目的:研究神经前体细胞表达发育调控样基因4(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like， NEDD4 L)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)复制的影响及其可能的分子机制。 方法:采用Lipofectamine2000分别将靶向 NEDD4 L的小干扰RNA、 NEDD4 L的过表达质粒(pcDNA3.1- NEDD4 L-HA)、HBV复制质粒(pGEM-HBV1.3)和poly(dAT：dAT)瞬时转染至HepG2细胞，并以可稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞为对照。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测 NEDD4 L、α干扰素、β干扰素、干扰素刺激基因56(interferon-stimulated gene 56， ISG56)、黏液病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A, MxA)、寡腺苷酸合成酶(oligoadenylate synthetase， OAS)等的mRNA水平，以及HBV DNA和3.5 kb HBV RNA的表达水平；采用蛋白质印迹法验证NEDD4L沉默或过表达效果，并检测相关信号分子的蛋白质水平；采用酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中β干扰素产量。统计学方法采用 t检验。 结果:HepG2.2.15细胞中的NEDD4L mRNA和蛋白质水平分别为10.53±0.47和4.17±0.43，分别高于HepG2细胞中的1.00±0.05和1.26±0.25，差异均有统计学意义( t＝3.27， P＝0.008； t＝1.68， P＝0.030)。在敲减 NEDD4 L基因表达的细胞中，上清液HBV DNA表达水平为0.32±0.09，低于对照组的1.00±0.05，差异有统计学意义( t＝－0.93， P＝0.020)；3.5 kb HBV RNA表达水平为0.49±0.11，低于对照组的1.00±0.05，差异有统计学意义( t＝－0.68， P＝0.040)。与对照组相比， NEDD4 L敲减组的β干扰素、 ISG56、 MxA和 OAS的mRNA相对表达水平均上升，差异均有统计学意义( t＝4.66、9.38、7.29、7.01，均 P<0.01)。 NEDD4 L敲减组β干扰素含量在poly(dAT：dAT)处理和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)刺激时分别为(776.41±115.49) ng/L和(961.21±130.19) ng/L，分别高于对照组的(320.15±56.05) ng/L和(440.17±67.82) ng/L，差异均有统计学意义( t＝2.43， P＝0.020； t＝2.85， P＝0.030)； NEDD4 L过表达组β干扰素含量在poly(dAT：dAT)处理和VSV刺激时分别为(156.18±26.47) ng/L和(176.67±34.51) ng/L，分别低于对照组的(320.38±49.39) ng/L和(440.59±68.83) ng/L，差异均有统计学意义( t＝－2.03， P＝0.040； t＝－1.93， P＝0.030)。HBV复制下调了β干扰素上游黑色素瘤分化相关蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)的蛋白质水平，而该下调作用在敲减 NEDD4 L的细胞中并不明显。 结论:HBV复制能通过促进细胞NEDD4L的表达，下调MDA5而抑制β干扰素的产生，进而辅助HBV的固有免疫逃逸。

目的:探讨HBV感染患者外周血干扰素刺激基因（ISGs）表达水平变化及其与干扰素治疗疗效的关系。方法:选取首都医科大学大兴教学医院2018年4月至2023年5月收治的80例HBV感染患者纳入HBV组，另选取同期进行健康体检者80例作为对照组。对比两组外周血黏病毒抗性蛋白A（MxA）mRNA、泛素特异性蛋白酶18（USP18）mRNA、细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3）mRNA表达水平，HBV组患者均给予重组人干扰素α-2b持续治疗24周，依照干扰素应答情况，分为干扰素应答组（n=38）与干扰素无应答组（n=42）两个亚组，通过Logistic回归分析外周血指标与干扰素应答的关系，并观察HBV组患者干扰素治疗前后MxA mRNA、USP18 mRNA、SOCS3 mRNA水平变化。结果:HBV组治疗前外周血MxA mRNA水平低于对照组，USP18 mRNA、SOCS3 mRNA水平高于对照组（P<0.05）；干扰素应答组治疗前外周血MxA mRNA水平高于干扰素无应答组，USP18 mRNA、SOCS3 mRNA水平低于干扰素无应答组（P<0.05）；Logistic回归分析显示USP18 mRNA、SOCS3 mRNA高表达是HBV感染患者干扰素无应答危险因素，MxA mRNA高表达是干扰素应答保护因素；干扰素应答组治疗前、治疗2周、12周、24周后外周血MxA mRNA表达水平高于干扰素无应答组，USP18 mRNA、SOCS3 mRNA表达水平低于干扰素无应答组（P<0.05）。结论:HBV感染者应用干扰素治疗中，MxA高表达、USP18、SOCS3低表达者具有较佳的干扰素应答疗效。

目的:研究外源性白介素17A(IL-17A)抗HBV活性及其可能存在的机制.方法:以分泌乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的PLC/PRF/5细胞为模型,通过外源性IL-17A处理细胞48 h,化学发光微粒子免疫技术和细胞免疫荧光技术分析细胞上清液和细胞内HBsAg含量,并以荧光定量PCR法(FQ-PCR)和Western blot检测细胞内抗病毒基因及其蛋白含量;pISRE-TA-luc转染至细胞并以IL-17A处理细胞48 h,荧光素酶活性检测干扰素刺激反应元件(ISRE)活性;以Western blot分析IL-17A处理细胞48 h后PI3K/AKT信号转导通路分子蛋白表达水平,并以信号转导通路抑制剂LY294002进一步验证IL-17A能否通过PI3K/AKT信号转导通路发挥抗HBV活性.结果:外源性IL-17A处理PLC/PRF/5细胞后,细胞上清液和细胞内HBsAg含量显著降低,同时细胞内抗病毒蛋白MxA和OAS表达明显升高;IL-17A不能增强细胞内ISRE活性,但激活PI3K/AKT信号转导通路;通过LY294002抑制PI3K/AKT信号转导通路后,IL-17A抗HBV活性及其诱导抗病毒蛋白MxA和OAS表达效应显著被抑制.结论:IL-17A能够通过激活PLC/PRF/5细胞内PI3K/AKT信号转导通路诱导抗病毒蛋白表达,从而发挥抗HBV活性.

目的:检测类风湿关节炎(RA)患者和正常对照组Ⅰ类干扰素(IFN)效应基因mRNA的表达,探讨IFN在RA发病过程中的意义.方法:收集32例RA患者和健康体检人群,分为治疗前RA组、治疗后RA组和正常对照组,患者均为首次就诊或未使用改变病情抗风湿药,留取全血,采用qPCR方法检测MXA、MXB、IFIT1、IFIT2、ISG15、HERC5、Ly6E、RSAD2、EPSTRI1、IFI44L、IFI35和IFI6基因mRNA的表达,检测血清抗CCP抗体和RF,比较mRNA组间基因表达差异及与自身抗体水平相关性.结果:IFIT1、ISG15、HERC5、MXA、MXB、Ly6E和RSAD2在治疗前RA患者组中的mRNA表达水平高于治疗后RA组(P<0.05),IFIT2、ISG15、HERC5、MXA、MXB、Ly6E、RSAD2、EPSTRLI1和IFI35在治疗前RA组中mRNA的表达水平均高于正常对照组(P<0.05),ISG15、HERC5、RSAD2在治疗后RA组中mRNA的表达水平均高于正常对照组(P<0.05).IFI6、IFIT2、IFI35、ISG15、MXB、Ly6E、EPSTRI1和MXA的mRNA的表达水平与抗CCP抗体呈正相关性(r=0.354~0.667,P<0.05),IFI6、IFIT2、IFI35、MXB、Ly6E、和MXA的mRNA的表达水平与RF呈正相关(r=0.362~0.579,P<0.05).结论:RA患者炎症细胞IFN效应基因mRNA表达升高,表明IFN可能是RA自身免疫反应的诱发因素.

目的 对MxA基因启动子多态性及HBeAg阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者应用替比夫定抗病毒治疗HBeAg,进一步分析遗传因子在乙肝病毒临床诊疗中发挥作用.方法 选取2013年3月-2016年9月于医院采取替比夫定治疗的135例C HB患者明确为研究对象,依据连续治疗的乙肝病毒学应答结果将患者分为完全应答(CR)组和非完全应答(NCR)组,并对两组患者的临床指标和人口学差异进行对比分析;根据M xA基因启动子的序列,扩增目的片段后直接测序进行基因分型,从而找出替比夫定抗病毒治疗HBeAg血清学转换相关联的阳性位点.结果 135例患者应用替比夫定治疗105周后,显示CR组为75例,NCR组60例;CR组患者的平均年龄低于NCR组(P=00.17);CR组患者在rs2071430位点的T等位基因频率比NCR组患者高(P=00.27);MxA基因启动子区rs2071430(-88G/T)次要等位基因频率为274.％,rs17000900(-123 C/A)次要等位基因频率为131.％,与Hardy-Weinberg平衡定律计算的预期值之间差异无统计学意义,分布均符合Hardy-Weinberg平衡.结论 M xA的基因启动子rs2071430与HBeAg阳性及替比夫定抗病毒治疗后血清学转换存在相关性;携带T等位基因的患者比携带G等位基因的患者HBeAg血清学转换更容易,T等位基因表现出更强的启动子活性.

目的 探讨IL-29在体外培养的小儿支气管上皮细胞中抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的作用及其相关机制.方法 建立RSV A2株感染的小儿分化良好的原代支气管上皮细胞(WD-PBEC)模型,经不同质量浓度(0、0.1、1、10、100 μg/L)人重组IL-29干预RSV感染的WD-PBEC后,观察人重组IL-29干预对RSV病毒滴度的影响.将WD-PBEC随机分为正常细胞组、IL-29干预组、RSV组、RSV+ IL-29组、RSV+Janus激酶(JAK)抑制剂组和RSV+JAK抑制剂+IL-29组.各IL-29干预组均经100 μg/L人重组IL-29预处理24 h;各RSV感染组在感染RSV A2株前均经100 μg/L人重组IL-29预处理24 h;各JAK抑制剂组先以JAK抑制剂Ⅰ预处理1h,再经100 μg/L人重组IL-29预处理24 h.采用实时荧光定量PCR检测细胞中黏病毒抵抗蛋白A(MxA)、2',5'寡腺苷酸合成酶(2',5'-OAS)、蛋白激酶R(PKR)和Toll样受体(TLR)3 mRNA的表达,Western印迹法检测TLR3、MxA、2',5'-OAS、信号转导和转录激活因子(STAT)1、磷酸化STAT(p-STAT)1、STAT2、p-STAT2的蛋白表达.结果 使用不同质量浓度人重组IL-29干预RSV感染的WD-PBEC后发现,IL-29延缓了病毒滴度的增高,其作用效果呈浓度依赖性,100 μg/L的IL-29作用96 h时抗病毒作用最佳.进一步实验结果显示,IL-29干预组的MxA、PKR和2',5'-OAS mRNA的表达均显著高于正常细胞组(P值均＜0.05).RSV组的MxA、PKR和2',5'-OAS mRNA的表达均显著低于IL-29干预组(P值均＜0.05),2',5'-OAS mRNA的表达显著高于正常细胞组(P＜0.05).IL-29+ RSV组的MxA mRNA的表达显著高于正常细胞组、IL-29干预组和RSV组(P值均＜0.05),PKR mRNA的表达显著低于IL-29干预组(P＜0.05),2',5'-OAS mRNA的表达显著高于正常细胞组和RSV组(P值均＜0.05).IL-29干预组的p-STAT2/STAT2和p-STAT1/STAT1均显著高于正常细胞组(P值均＜0.05).RSV组的p-STAT2/STAT2均显著低于正常细胞组和IL-29干预组(P值均＜0.05),p-STAT1/STAT1均显著高于正常细胞组和IL-29干预组(P值均＜0.05).IL-29+RSV组的p-STAT2/STAT2显著低于IL-29干预组(P＜0.05),显著高于RSV组(P＜0.05),而与正常细胞组间的差异无统计学意义(P＞0.05);p-STAT1/STAT1显著高于正常细胞组、IL-29干预组和RSV组(P值均＜0.05).RSV+JAK抑制剂组的TLR3 mRNA、MxA mRNA和MxA蛋白相对表达量均显著低于RSV组(P值均＜0.05).IL-29+RSV组的TLR3、MxA,以及2',5'-OAS mRNA和蛋白相对表达量均显著高于RSV组和RSV+JAK抑制剂组(P值均＜0.05).RSV+JAK抑制剂+IL-29组的MxA mRNA和蛋白相对表达量均显著低于RSV组和IL-29+ RSV组(P值均＜0.05),均显著高于RSV+JAK抑制剂组(P＜0.05);2',5'-OAS mRNA和蛋白相对表达量均显著高于RSV组和RSV+JAK抑制剂组(P值均＜0.05),均显著低于IL-29+ RSV组(P值均＜0.05).结论 IL-29能以剂量依赖的方式在体外培养的小儿支气管上皮细胞中通过调控TLR3和抗病毒蛋白MxA、2',5'-OAS表达发挥抗RSV作用,该作用可能部分依赖于JAK/STAT信号通路的激活.

干扰素α(IFN-α)是临床最常用的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物之一.泛素特异性蛋白酶18(USP18)被证实是抑制IFN-α抗HBV活性的因子,但USP18是否对干扰素λ(IFN-λ)抗HBV有影响还尚未可知.为了明确USP18对IFNλ抗HBV活性的影响,本研究以HepG2.2.15细胞作为乙肝体外模型,采用脂质体转染法分别向细胞转染pEGFP-USP18、PEGFP-N1经48 h,再经IFN-α和IFN-λ处理24 h,分为阴性对照组、USP18过表达+IFN-α组、空载组+IFN-α组、USP18过表达+ IFN-λ组、空载组+IFN-λ组.采用Western印迹、RT-qPCR和ELISA检测各组的乙肝病毒标志物、STAT1/pSTAT1和下游的干扰素刺激基因(ISGs)的表达.结果显示,与阴性对照组和空载组相比,USP18蛋白在过表达组明显升高(P＜0.05),过表达细胞模型构建成功;在IFN-α处理的两组中,空载组中HBsAg、HBeAg、HBcAg及HBV-DNA的表达均低于USP18过表达组,差异有统计学意义(P＜0.05).而IFN-λ处理组中,乙肝病毒标志物的差异不明显.在IFN-α处理组中,空载组的ISG15、MxA、IFIT1和pSTAT1表达均高于USP18过表达组,差异有统计学意义(P＜0.05),而在IFN-λ处理组中ISGs和pSTAT1的表达无明显差异.上述结果证实,USP18可通过抑制JAK/STAT信号通路的激活来减弱IFN-α抗HBV的活性.研究还证实,IFN-λ可发挥抗HBV的作用,USP18不通过JAK/STAT信号通路抑制其抗HBV活性.

目的 研究白细胞介素27(IL-27)对HepG2.2.15细胞乙型肝炎病毒(HBV)复制、抗原分泌的影响及其机制.方法 以(0、20、50) ng/mL IL-27处理HepG2.2.15细胞,采用荧光定量PCR检测细胞上清液HBV-DNA水平,ELISA检测细胞上清液HBV表面抗原(HbsAg)和HBV e抗原(HBeAg)含量;免疫细胞化学染色法检测细胞HBV核心抗原(HBcAg)的表达和定位,Western blot法检测细胞信号转导子与转录激活子1(STAT1)、磷酸化的STAT1(p-STAT1)、黏病毒抗性蛋白A(MxA)的蛋白水平.结果 不同剂量IL-27处理后,HepG2.2.15细胞上清中HBV-DNA、HBsAg、HBeAg及细胞内HBcAg含量逐渐下降;随着IL-27剂量升高,细胞内p-STAT1表达水平显著上升,而STAT1表达未见明显变化;进一步研究发现,IL-27能诱导HepG2.2.15细胞表达重要抗病毒蛋白MxA,呈剂量和时间依赖性.结论 IL-27通过激活STAT1信号途径诱导MxA表达发挥抗HBV活性.

目的 旨在了解黏病毒抗性蛋白A(MxA)在不同炎性肌病肌纤维中的表达情况,探讨MxA在皮肌炎病理诊断中的应用价值.方法 本研究采用回顾性研究方法.收集2013至2017年所做的炎性肌病肌活检标本和临床资料,其中皮肌炎18例为皮肌炎组,其他炎性肌病22例(免疫介导坏死性肌病7例,包涵体肌炎6例,抗合成酶抗体综合征5例,重叠性肌炎4例)为对照组.采用免疫组化学法评估MxA在不同炎性肌病肌纤维中的表达情况,并与皮肌炎病理特征①束周萎缩;②主要组织相容性复合体-Ⅰ (MHC-Ⅰ)束周表达上调;③毛细血管膜攻击复合物(C5b-9)沉积进行比较.结果 皮肌炎组15例患者的肌纤维MxA表达上调,以束周肌纤维上调最为明显;对照组未见表达上调.MxA对皮肌炎诊断的敏感度和特异度分别为83％和100％,束周萎缩的敏感度和特异度分别为72％和95％.MHC-Ⅰ束周表达上调的敏感度和特异度分别为50％和86％.毛细血管C5b-9沉积的敏感度和特异度分别为39％和81％.将束周萎缩或MxA阳性(合集)作为一个指标,其敏感度和特异度分别高达94％和100％.结论 MxA对皮肌炎诊断的敏感度和特异度较经典的皮肌炎病理标志束周萎缩更高,也优于MHC-Ⅰ的束周表达上调及毛细血管C5b-9沉积.MxA染色对炎性肌病的诊断和鉴别诊断具有较高的参考价值.

黏病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A,MxA)是由干扰素诱导的具有重要抗乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)功能的蛋白质,我们前期工作发现,MxA主要依赖其中心互作结构域(central interactive domain,CID)与病毒直接相互作用发挥功能,但其具体的抗病毒功能区以及功能区是否具有独立的抗病毒活性仍不清楚.本研究拟鉴定MxA蛋白上的抗乙肝病毒活性肽.首先从全长MxA构建缺失突变体△CID和截短体CID,以HepG2.2.15细胞为病毒模型,分别转染空载质粒、MxA、△CID和CID,免疫荧光法检测转染效率,Western印迹法检测质粒表达,酶联免疫法测定细胞培养液中HBsAg、HBeAg的量及荧光定量PCR法测定乙肝病毒DNA的量,评估CID段的抗乙肝病毒活性.根据CID段的晶体结构,缩短肽段长度,构建α1、α2、α3等9段肽段质粒,鉴定各段的抗乙肝病毒活性和细胞毒性(MTT法).运用计算生物学手段——分子对接法预测MxA蛋白与病毒相互作用的模式和位点.结果 显示,△CID、CID和9段肽段质粒的序列及表达正确,9段肽段的表达量未见显著性差异,无显著的细胞毒性.CID组和黏病毒抗性蛋白A组较对照组乙肝病毒的复制水平显著降低,CID组细胞上清中HBsAg、HBeAg及乙肝病毒DNA的量分别减少了55.57％±8.48％、68.37％±6.24％、66.67％±6.40％,P＜O.01;MxA组的3个指标分别减少了61.63％±3.11％、70.77％±7.25％、73.73％±6.18％,P＜O.01;ΔCID组较对照组无明显变化.9段肽段中α1组较对照组HBsAg、HBeAg及乙肝病毒DNA的量有显著下降,分别减少了48.33％±1.70％、70.67％+3.30％、68.95％±2.55％,P＜0.001,表明α1对乙肝病毒具有强抑制活性.分子对接的结果显示,384～408位氨基酸是MxA蛋白与病毒互作的关键位点,该区域落在α1肽段上,验证了α1是MxA蛋白抗乙肝病毒及与乙肝病毒相互作用中的关键区段.本研究筛选并鉴定出人干扰素诱导蛋白MxA上最有效的抗乙肝病毒活性肽α1,研究结果为抗乙肝病毒多肽类新药的研发奠定了基础.