目的:基于生物信息学方法筛选肾透明细胞癌关键基因，识别可能的微RNA（miRNA）-mRNA作用轴，探讨相关基因在肾透明细胞癌组织和细胞中的表达。方法:选取基因表达综合（GEO）数据库基因表达谱GSE40435、GSE71302数据集，肾透明细胞癌TCGA-KIRC数据集来自癌症基因组图谱（TCGA）数据库。采用R软件筛选差异表达的mRNA和miRNA，并对mRNA进行功能富集分析。采用STRING数据库和Cytoscape软件进行蛋白质互作分析。采用Oncomir数据库筛选预后相关的差异表达miRNA。采用TargetScan和miRDB靶基因预测工具筛选miRNA可能调控的靶基因。收集2021年6月至12月山西医科大学第一医院收治的34例肾透明细胞癌患者的组织样本及临床资料，并选择正常肾细胞株293T和肾透明细胞癌细胞株786O。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测基因的相对表达量；蛋白质印迹法、免疫组织化学染色法检测目的蛋白的表达水平；双荧光素酶报告基因实验验证基因间的靶向关系。结果:差异分析筛选得到1 351个差异表达mRNA和50个差异表达miRNA。功能富集分析提示肾透明细胞癌中脂肪酸代谢、异生物质代谢等途径被抑制，细胞凋亡、免疫应答途径被激活。蛋白质互作分析提示肾透明细胞癌中信号转导、蛋白泛素化等途径起到关键作用。筛选结果显示miRNA-224-5p（miR-224-5p）与肾透明细胞癌进展关系最紧密，且在肿瘤组织中高表达，其预后相关靶基因为NEDD4L。肾透明细胞癌组织与癌旁组织的NEDD4L mRNA相对表达量分别为0.138±0.103、1.000±0.026（ t＝46.23， P<0.05）；miR-224-5p相对表达量分别为1.000±0.043、0.129±0.108（ t＝45.28， P<0.05）。不同分级及分期肾透明细胞癌组织NEDD4L mRNA、miR-224-5p的表达差异均有统计学意义（均 P<0.05）。NEDD4L蛋白在肾透明细胞癌中表达降低。293T与786O细胞中NEDD4L基因相对表达量分别为1.000±0.125、0.210±0.044 （ t＝17.52， P<0.05）；miR-224-5p基因相对表达量分别为0.209±0.049、1.000±0.234（ t＝10.609， P<0.05）。转染后的293T细胞样本中，miRNA模拟物组与阴性对照组的NEDD4L mRNA相对表达量分别为0.236±0.062、1.000±0.024，差异有统计学意义（ t＝43.56， P<0.05）。NEDD4L蛋白在miRNA模拟物组中表达降低。双荧光素酶报告基因实验提示NEDD4L是miR-224-5p的直接靶基因。 结论:在肾透明细胞癌中，miR-224-5p靶向调节NEDD4L表达，这一机制可能与肾透明细胞癌的发生、发展有关。

目的:对1例临床表现为全面发育迟缓、智力低下、腭裂、癫痫及四肢肌张力低下的患儿进行全外显子组测序分析，以明确其遗传学病因。方法:抽取患儿及其父母外周血，提取全基因组DNA，应用二代测序技术对全外显子组基因进行变异检测、生物信息学预测分析及Sanger测序验证。结果:测序结果显示患儿 NEDD4L基因发生c.2117T>C(p.Leu706Pro)杂合变异，经Sanger验证患儿父母未检出该变异，为一新发变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会(ACMG)的指南预测c.2117T>C为疑似致病性变异。 结论:NEDD4L基因c.2117T>C(p.Leu706Pro)变异可能为患儿的遗传学病因。

目的:研究神经前体细胞表达发育调控样基因4(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated gene 4-like， NEDD4 L)对乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)复制的影响及其可能的分子机制。 方法:采用Lipofectamine2000分别将靶向 NEDD4 L的小干扰RNA、 NEDD4 L的过表达质粒(pcDNA3.1- NEDD4 L-HA)、HBV复制质粒(pGEM-HBV1.3)和poly(dAT：dAT)瞬时转染至HepG2细胞，并以可稳定表达HBV的HepG2.2.15细胞为对照。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测 NEDD4 L、α干扰素、β干扰素、干扰素刺激基因56(interferon-stimulated gene 56， ISG56)、黏液病毒抗性蛋白A(myxovirus resistance protein A, MxA)、寡腺苷酸合成酶(oligoadenylate synthetase， OAS)等的mRNA水平，以及HBV DNA和3.5 kb HBV RNA的表达水平；采用蛋白质印迹法验证NEDD4L沉默或过表达效果，并检测相关信号分子的蛋白质水平；采用酶联免疫吸附测定法检测细胞上清液中β干扰素产量。统计学方法采用 t检验。 结果:HepG2.2.15细胞中的NEDD4L mRNA和蛋白质水平分别为10.53±0.47和4.17±0.43，分别高于HepG2细胞中的1.00±0.05和1.26±0.25，差异均有统计学意义( t＝3.27， P＝0.008； t＝1.68， P＝0.030)。在敲减 NEDD4 L基因表达的细胞中，上清液HBV DNA表达水平为0.32±0.09，低于对照组的1.00±0.05，差异有统计学意义( t＝－0.93， P＝0.020)；3.5 kb HBV RNA表达水平为0.49±0.11，低于对照组的1.00±0.05，差异有统计学意义( t＝－0.68， P＝0.040)。与对照组相比， NEDD4 L敲减组的β干扰素、 ISG56、 MxA和 OAS的mRNA相对表达水平均上升，差异均有统计学意义( t＝4.66、9.38、7.29、7.01，均 P<0.01)。 NEDD4 L敲减组β干扰素含量在poly(dAT：dAT)处理和水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)刺激时分别为(776.41±115.49) ng/L和(961.21±130.19) ng/L，分别高于对照组的(320.15±56.05) ng/L和(440.17±67.82) ng/L，差异均有统计学意义( t＝2.43， P＝0.020； t＝2.85， P＝0.030)； NEDD4 L过表达组β干扰素含量在poly(dAT：dAT)处理和VSV刺激时分别为(156.18±26.47) ng/L和(176.67±34.51) ng/L，分别低于对照组的(320.38±49.39) ng/L和(440.59±68.83) ng/L，差异均有统计学意义( t＝－2.03， P＝0.040； t＝－1.93， P＝0.030)。HBV复制下调了β干扰素上游黑色素瘤分化相关蛋白5(melanoma differentiation-associated protein 5，MDA5)的蛋白质水平，而该下调作用在敲减 NEDD4 L的细胞中并不明显。 结论:HBV复制能通过促进细胞NEDD4L的表达，下调MDA5而抑制β干扰素的产生，进而辅助HBV的固有免疫逃逸。

Epilepsy is a disorder of the brain charac-terized by abnormal neuron excitability.However,the underlying molecular mechanism of neuron excitability modulation remains elusive.With the help of bioinformatic methods,we have identified receptor-type tyrosine-pro-tein phosphatase-like N(PTPRN)as a critical gene dur-ing epileptogenesis.PTPRN recruits NEDD4L ubiquitin E3 ligase to NaV1.2 sodium channels,facilitating NEDD4L-mediated ubiquitination and endocytosis.Knockout of PTPRN endows hippocampal granule cells with augmented depolarization currents and higher intrinsic excitability,which is reflected by increased seizure susceptibility of transgenic mice.On the contrary,reduced neuron excit-ability and decreased seizure susceptibility are observed after PTPRN overexpression.Meanwhile,we find that a 133 aa fragment recaptures modulation effect of PTPRN full-length,and this fragment shows therapeutic potential towards epilepsy caused by NaV1.2 gain of function vari-ants.In brief,our results demonstrate PTPRN playsa criti-calroleinregulatingneuronexcitability,providing a poten-tial therapeutic approach for epilepsy.

高血压是最常见的一种慢性病,也是目前公认的脑卒中、动脉瘤、 心力衰竭、心肌梗死和肾脏损害等的重要危险因素,因此高血压发病机制是目前研究的热点.泛素化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,可以通过蛋白酶体途径介导蛋白质降解,是调节细胞蛋白表达水平和功能的重要机制之一.泛素化是一个级联酶促反应过程,泛素E3连接酶是泛素化过程中最重要的酶,它决定了底物的特异性,泛素E3连接酶的底物中有很多是肾脏重要的离子通道蛋白,如ENaC、NCC、NHE 3等,表明泛素化可调控它们的降解,影响其活性及膜定位,进而影响肾脏水电解质平衡,与高血压发生密切相关.

目的:探讨神经前体细胞发育相关受控表达分子8(NEDD8)共价修饰抑制因子MLN4924对人卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响,并分析其可能机制.方法:使用不同浓度 MLN4924(0、0.125、0.25、0.5 μmol/L)处理人卵巢癌细胞株SKOV34 h,免疫印迹法检测PAR3、HER2、Neddylated-cullins、P-IκBα的表达水平;同时取细胞培养上清用ELISA检测IL-6的分泌.不同浓度MLN4924处理SKOV3细胞72 h,CCK8法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率.结果:MLN4924作用4 h时,能够使Neddylated-cullins下降、P-IκBα积聚,IL-6分泌减少,而PAR3、HER2表达水平变化不显著.MLN4924在0.125、0.25和0.5 μmol/L的浓度下处理SKOV3细胞72 h时,对细胞增殖有明显的抑制作用,并且随着剂量的加大,抑制效果也显著提高;同时加药组S期细胞百分率相较于对照组明显升高,且形成大量四倍体,使之没有完整的细胞周期;细胞凋亡率也随MLN4924剂量增大而升高.结论:NEDD8修饰特异性抑制剂 MLN4924能够明显抑制人卵巢癌细胞株SKOV3的增殖,诱导细胞周期阻滞和凋亡.上述效应可能与NF-κB通路活性受到抑制和IL-6表达下降有关.

目的 研究胃癌中神经前体细胞表达发育下调样基因4(NEDD4L)的表达及其临床意义.方法 分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测25对胃癌组织及其对应癌旁正常胃组织中NEDD4L的mRNA和蛋白表达水平,采用免疫组化方法(IHC)检测NEDD4L在124例胃癌组织和25例癌旁正常胃组织中的表达情况,并统计分析其表达与胃癌患者临床病理参数及预后之间的关系.结果 NEDD4L在胃癌组织中的mRNA和蛋白表达水平均显著低于对应癌旁正常组织(P＜0.05).免疫组化结果显示NEDD4L在胃癌组织中的阳性表达率明显低于癌旁正常组织(P＜0.05).NEDD4L的表达与肿瘤组织分化程度(P ＜ 0.05)、浸润深度(P ＜ 0.05)和临床TNM 分期(P ＜ 0.05)显著相关,且NEDD4L 高表达的胃癌患者其预后较好(P ＜ 0.001).结论NEDD4L 在胃癌组织中低表达,可能与胃癌的发生发展密切相关,且可能作为判断胃癌预后的潜在指标.

目的:研究胰岛素减轻脂多糖对肺泡II型上皮细胞Na+-K+-ATPaseα1亚基表达抑制的分子机制.方法:以A549细胞为研究对象,脂多糖(1μg/mL)诱导8 h后,再加用胰岛素(100 nmol/L)处理4 h,采用Western blot法检测Na+-K+-ATPaseα1亚基表达及AKT、ERK1/2、p70 s6 k、NEDD4-2总蛋白表达及其磷酸化水平变化.结果:A549细胞在1μg/mL脂多糖作用下,Na+-K+-ATPaseα1亚基蛋白表达显著降低.胰岛素处理可部分解除脂多糖对A549细胞Na+-K+-ATPaseα1亚基表达的抑制.胰岛素上调Na+-K+-ATPaseα1亚基表达是通过改变PI3 K/AKT及PI3 K/ERK通路中关键蛋白AKT、NEDD4-2、ERK1/2、p70 s6 k的磷酸化水平来实现的.结论:胰岛素通过调控PI3 K/AKT及PI3 K/ERK通路部分解除脂多糖对肺泡II型上皮细胞Na+-K+-AT-Paseα1亚基表达的抑制,这为临床上采用胰岛素干预急性呼吸窘迫综合征提供了初步实验依据.

目的 探讨泛素E3连接酶Nedd4L在Pendrin泛素化修饰中的作用及对Pendrin表达的影响.方法 培养293T细胞,Co-IP实验验证Nedd4L与Pendrin存在体内结合;构建Nedd4L真核细胞表达载体;转染293T细胞后Western Blot检测Pendrin的表达量以及泛素化程度.结果 Co-IP实验证实Nedd4L与Pendrin在293T细胞中存在体内结合;真核表达载体构建,能够表达完整Nedd4L蛋白;转染72h后,Pendrin在293T细胞中的表达量降低,泛素化修饰增加,在细胞膜表面表达降低.结论 Nedd4L能够结合Pendrin并通过促进其泛素化修饰以及降低细胞膜表面表达量.其机制可能是通过促进Pendrin泛素化修饰诱导Pendrin内化并进入泛素蛋白酶体途径降解.

目的 采用生物信息学方法分析miR-30d-5p在注意缺陷多动障碍(ADHD)发病机制中的作用.方法 通过TargetScan7.2、miRDB和miRTarBase数据库预测miR-30d-5p的靶基因,利用Cytoscape 3.7.1软件中的ClueGO插件对靶基因进行GO和KEGG富集分析,同时通过Cytoscape 3.7.1软件中的STRING插件构建靶蛋白互作(PPI)网络并筛选出核心基因,通过与ADHD gene数据库中已验证的ADHD相关基因对比,分析miR-30d-5p在ADHD中的作用和意义.结果 GO富集显示miR-30d-5p靶基因定位到核质、细胞内细胞器、轴突、细胞膜等细胞结构,并在神经系统中广泛参与到神经元发育、分化、神经元发生的调节、神经元投射发育、顺式调控区结合及顺式调控区序列特异性DNA结合等生物过程.KEGG富集显示miR-30d-5p靶基因显著富集在FoxO信号通路、轴突导向、海马长时程增强和神经营养信号通路.NOTCH1、KRAS、SIRT1、MAPK8、SOCS3、NEDD4、SKP2、BDNF、NEDD4L、SOCS1为miR-30d-5p预测靶基因的PPI网络中的核心基因.与ADHD gene数据库对比结果显示miR-30d-5p预测靶基因有33个基因与ADHD相关,且33个基因中含有预测核心基因BDNF.结论 miR-30d-5p通过靶向调控BDNF基因参与ADHD发生发展的过程,miR-30d-5p有潜力成为ADHD诊疗相关的靶点.