目的:建立一种快速、准确、高灵敏度检测基孔肯雅病毒（chikungunya virus，CHIKV）的逆转录-酶促重组等温扩增（reverse transcription enzymatic recombinase amplification，RT-ERA）的基因检测技术方法。方法:以CHIKV非结构蛋白1（non-structural protein 1，NSP1）基因的保守序列为靶标，根据RT-ERA反应原理设计、合成荧光探针及对应引物，以pUC18为载体构建靶标质粒并在体外转录后作为阳性对照品，将阳性对照品倍比稀释后筛选出扩增效率最高的探针引物组合。利用筛选的探针引物组合，对不同拷贝数的CHIKV进行荧光RT-ERA法扩增，评价该方法的最低检出限；再分别以森林脑炎病毒、登革热病毒、寨卡病毒、乙型脑炎病毒、新布尼亚病毒的RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增，评价该方法的特异性。结果:在40 ℃恒温条件下，利用荧光RT-ERA法10 min内可以完成CHIKV核酸扩增，该方法最低检出限可达10拷贝/μL，且当CHIKV核酸扩增为阳性时，其他病毒检测结果为阴性。结论:成功建立一种可用于检测CHIKV NSP1基因的荧光RT-ERA法，该方法操作简便、检测限低且特异性好。

目的:分析2株插入和表达外源基因的重组轮状病毒rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD在MA104细胞上连续传代增殖的遗传稳定性。方法:将2株重组轮状病毒滴度测定后，按照MOI0.01传至P2代，随后按1∶100稀释并活化上一代病毒裂解液，连续18代(P20)感染MA104细胞，用间接免疫荧光法测定P1，P5，P10，P15，P20代细胞裂解液病毒滴度，进行RT-PCR鉴定以及dsRNA-PAGE银染实验，并检测rLLR/NSP3-NLuc的荧光素酶活性。结果:重组轮状病毒rLLR/NSP3-NLuc在20代内均未发现插入片段丢失，重组病毒滴度为3.85～5.16×10 6 FFU/ml，各代次均有较强的荧光素酶信号。重组轮状病毒rLLR/NSP3-CoV2/RBD在第6代出现了插入片段的丢失，该重组病毒前5代的感染性滴度为：2.6～3.36×10 6 FFU/ml。 结论:NSP3基因末端插入582 bp NLuc的重组轮状病毒具有很好的遗传稳定性，而NSP3基因末端插入885 bp RBD的重组轮状病毒仅在前5代稳定，提示重组轮状病毒NSP3基因末端可以插入和表达外源基因，但其稳定性需要更深入研究。

目的:了解2020年福州市哨点医院5岁以下腹泻住院儿童粪便样本中A组轮状病毒(group A rotavirus, RVA)的基因组特征。方法:通过ELISA对腹泻住院儿童粪便样本进行RVA筛查，采用RT-PCR方法扩增RVA阳性样本的11个基因节段并进行Illumina二代测序，使用MEGA等生物学软件对重要基因片段进行序列分析和抗原位点分析。结果:成功获得20株RVA全基因组序列，包括4种G/P基因组合G9P[8](55%)、G3P[8](25%)、G8P[8](15%)以及G2P[4](5%)，全基因组中DS-1-like重配株比例占40%(8/20)。相同型别的RVA序列同源性高，且与现今世界流行的毒株亲缘关系近。VP7、VP4和NSP4片段氨基酸位点变异情况复杂，重要抗原位点存在多处氨基酸变异情况发生。结论:在福州地区首次检测到G3P[8]型和G8P[8]型DS-1-like重配株，VP7、VP4和NSP4片段抗原位点上存在变异。鉴于不常见DS-1-like重配株的检出和多个重要抗原位点变异现象的出现，有必要对RVA全基因组特征进行持续监测，为疫情防控和疫苗的免疫策略提供科学依据。

目的:探讨江苏省新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）非结构蛋白1（nonstructural protein 1，NSPl）变异情况及其与临床分型的关系。方法:收集2020—2022年间江苏省SARS-CoV-2感染病例的样本及基本临床信息。对样本进行高通量测序，测序后的数据以Wuhan-Hu-1（GenBank：MN908947.3）为参考基因分析NSP1序列变异情况及其与临床分型的关系。使用DynaMut在线服务器分析突变氨基酸对蛋白质稳定性及分子柔韧性的影响。结果:共收集病例样本1 241例，NSP1基因同义突变61例，错义突变及缺失共487例，存在氨基酸变异的患者以无症状感染者（75.4%）为主，且病例临床分型严重程度更轻（ Z=-24.8， P<0.01）。共发现NSP1蛋白出现11个非同义突变和1个缺失。N端中出现了8个稳定突变及1个失稳突变，2个突变增加了分子柔韧性；Linker区S135R的突变使蛋白质失稳但增加了柔韧性；C端R171C突变使蛋白质稳定但降低了柔韧性。NSP1蛋白稳定性降低的患者临床分型症状更轻。 结论:NSP1部分氨基酸的改变使蛋白结构发生变化，可能降低病毒的致病力，导致较轻的临床症状。

目的:探讨新型冠状病毒(2019 novel coronavirus, 2019-nCoV)非结构蛋白1(NSP1)重要变异对其与病毒5’UTR结合能力的影响，为抗病毒药物和疫苗的研发提供线索。方法:对2019-nCoV基因组数据库进行生物信息分析，选取可能影响NSP1结构及与5’UTR的结合能力的氨基酸变异位点(T12A、R124L、N128I、K141A、GHVMV82-86DEL及KSF141-143DEL)，PSIPRED在线工具分析变异体的二级结构，mCSM-NA预测其与RNA的结合能力，DynaMut webserver分析变异对蛋白稳定性的影响；构建变异体质粒，转染HEK-293T细胞，利用双荧光素酶报告基因实验和RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA binding protein immunoprecipitation，RIP)实验检测NSP1变异体与病毒5’UTR的结合能力。结果:生物信息分析预测除了R124L突变外，其他5种变异体均可改变蛋白二级结构，T12A、R124L、N128I和K141A突变均可以降低与RNA的结合能力，而T12A、R124L、N128I突变降低了蛋白质的稳定性，实验表明R124L、N128I、GHVMV82-86DEL及KSF141-143DEL显著减弱了NSP1与5’UTR的结合能力。结论:部分NSP1氨基酸突变或缺失可改变其二级结构，并能够显著减弱NSP1与5’UTR的结合能力，提示可能改变病毒的致病能力，为抗病毒药物和疫苗的研发提供了理论依据。

轮状病毒(rotavirus，RV)是引起5岁以下儿童腹泻病的主要病原体之一，但RV感染性腹泻的发生机制尚不明确。RV基因组编码6个结构蛋白(VP1~VP4、VP6和VP7)和6个非结构蛋白(NSP1~NSP6)，其中NSP4可与RV其他非结构蛋白或结构蛋白相互作用产生相应的生物学功能，是RV感染、复制和腹泻机制中的关键因素。本文就目前国内外关于NSP4结构与功能的相关研究进行综述。

目的:研究一株G4P[6]基因型A组轮状病毒（group A rotavirus，RVA）CZ079的全基因组特征及进化规律。方法:利用逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）对CZ079的VP7、VP4、VP6、NSP1节段分别进行RT-PCR扩增，通过在线RVA自动分型工具对其分型，采用DNAstar5.1和Mega11.0软件对各节段进行同源性及遗传进化分析。结果:CZ079毒株基因型为G4-P[6]-I5-R1-C1-M1-A8-N1-T1-E1-H1。VP6为I5型，NSP1为A8型。CZ079与LLR?、RotaTeq?和Rotarix?三种疫苗株在VP7的抗原表位中7-1b区域均存在氨基酸差异；VP4蛋白裂解后的VP8*抗原表位中8-1、8-2、8-3、8-4、5-1区域存在较大差异。结论:2022年RVA毒株CZ079为罕见的G4P[6]-I5-A8型，推测该基因型RVA是由越南等东南亚地区传入中国，与中国RVA发生重配产生的新型重配毒株。

目的:研究miR-125b-1-3p在轮状病毒(rotavirus)复制过程中的作用和调控机制。方法:将MA104细胞中的miR-125b-1-3p分别上调和下调后感染轮状病毒，通过RT-PCR分析miR-125b-1-3p的表达情况和轮状病毒拷贝数；免疫荧光分析miR-125b-1-3p对轮状病毒蛋白表达情况的影响；Western blot分析miR-125b-1-3p参与调控的相关蛋白表达情况。结果:轮状病毒感染细胞后，miR-125b-1-3p的表达水平明显上调，上调miR-125b-1-3p后，轮状病毒的VP7、NSP3基因拷贝数下降，下调miR-125b-1-3p后，轮状病毒的VP7、NSP3基因拷贝数明显升高；上调miR-125b-1-3p的表达水平后轮状病毒蛋白荧光数下降，下调miR-125b-1-3p后，病毒蛋白荧光数增加；轮状病毒感染细胞16 h后PI3K/Akt通路活性受到抑制，上调miR-125b-1-3p能够抑制PI3K/Akt通路的活化。结论:miR-125b-1-3p通过调控PI3K/Akt通路抑制轮状病毒的复制。研究结果为探讨miR-125b-1-3p和PI3K/Akt通路之间的具体调控机制研究提供了实验基础，为轮状病毒抗感染治疗提供了靶点。

目的:分析天津市1例输入性基孔肯亚病毒（CHIKV）的全基因组序列特征与进化，为CHIKV的监测与防控提供科学依据。方法:收集2019年11月4日于天津市第二人民医院采集的血清标本200 μl提取核酸，设计叠瓦式引物扩增CHIKV基因组全长，然后利用Illumina Miniseq平台进行高通量测序。结果:本研究的CHIKV属于ECSA基因型印度洋分支，与大部分中国分离株一致，相似性为92.72%~99.86%，在国际上与巴基斯坦分离株亲缘关系最近（99.74%）。天津CHIKV在关键位点E1-D284E和E2-I211T处有两处突变，与ECSA基因型一致。此外，天津CHIKV还具备两个关键毒力位点E2-12T和E2-82G，以及nsP3-R524Opal终止子突变。结论:天津CHIKV具备较强毒力，且具备在白纹伊蚊中传播的能力，提示应继续加强对CHIKV的监测。

目的:对GI.1型札如病毒进行全基因组扩增测序尝试并开展初步分析。方法:利用本研究设计的GI组札如病毒全基因组5’末端通用引物及杯状病毒3’末端引物，对本实验室保存的两株GI.1型札如病毒标本进行全基因组扩增，然后进行文库构建、上机测序及序列组装。通过BioEdit软件进行序列比对分析，采用MEGA 7.0软件构建进化树进行进化分析。结果:两个标本测序质量优异，测序方法具有可行性；在全基因组（WGS）、NSP基因、VP1基因及VP2基因进化树中，均归类为GI.1型；位点变异分布于各个基因片段，但VP1基因的N端保守性较好，熵值较低；大部分基因的核苷酸突变尤其是NS3、NS5及VP1基因的核苷酸突变以同义突变为主，未形成相应氨基酸的突变。结论:成功地开展了对GI.1型札如病毒全基因组扩增测序及相关进化分析，为札如病毒的检测提供了新的思路。