目的:观察Ngn2基因(Ngn2)诱导的神经潜能骨髓间充质干细胞(MSCs)和Janus激酶信号转导及转录激活因子(JAK-STAT)信号通路抑制剂AG490联合移植对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的神经保护作用。方法:体外培养MSCs(南京医科大学药学院实验室培养)并将Ngn2基因转染MSCs，细胞免疫荧光观察基因转染后神经细胞标记蛋白表达情况。制备大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。100只SD大鼠按照随机数字表达分为5组，分别设为Sham组，1%二甲基亚砜(DMSO)组、AG490组、Ngn2-MSCs+1%DMSO移植组、Ngn2-MSCs+AG490移植组。移植治疗24 h后原位缺口末端标记法(TUNEL)法检测大鼠脑缺血区细胞凋亡水平。分别于3、7、14 d对每组大鼠进行神经缺陷症状评分，14 d后处死动物，氯化三苯四唑(TTC)法染色后计算脑梗死体积，干湿重法称量脑含水量。结果:Ngn2转染MSCs后，Ngn2-MSCs细胞表现出向神经细胞分化的潜能，Ngn2-MSCs联合AG490移植治疗组中大鼠脑缺血区细胞凋亡水平(16.2±5.6， F＝197.53， P<0.01)、脑梗死体积[(12.31±6.24)%， F＝35.92， P<0.01]及脑含水量[(77.55±0.53)%， F＝56.18， P<0.01]较其他各组明显降低，神经缺陷评分在移植后7 d较其他各组开始降低(3.31±0.46， F＝14.47， P<0.01)，移植治疗14 d后评分显著较其他组降低(1.63±0.35， F＝22.71， P<0.01)。 结论:Ngn2-MSCs联合AG490移植疗法对脑缺血再灌注损伤有明显协同神经保护作用。

目的:探讨长链非编码RNA 钾电压门控通道亚家族Q成员1重叠转录物1（Kcnq1ot1）通过调节miR-92a-1-5p影响胰岛β细胞胰岛素分泌的作用机制。方法:自2020年6至12月在中山大学附属第三医院招募初诊2型糖尿病（T2DM）患者25例，同时招募年龄匹配且无糖尿病的受试者21例作为对照组。收集受试者的年龄、体重指数（BMI），检测空腹血糖（FPG）和糖化血红蛋白（HbA 1c），采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测血清中Kcnq1ot1表达量，并分析其与FPG和HbA 1c的相关性。12只5周龄雄性C57BL/6J小鼠采用随机数字表法分为高脂饮食（HFD）组（ n=6）和正常饮食（CD）组（ n=6），喂养20周后，提取原代胰岛细胞RNA。将体外培养的Min6细胞分为牛血清白蛋白（BSA）组和棕榈酸（PA，400 μmol/L）组；按照是否转染Kcnq1ot1 siRNA分为si-NC组和si-Kcnq1ot1组；按照是否转染miR-92a-1-5p的模拟物或抑制剂分为：模拟物对照组、模拟物组、抑制剂对照组和抑制剂组；按照转染Kcnq1ot1/NC siRNA后是否加入抑制剂分为si-NC+抑制剂对照组、si-Kcnq1ot1+抑制剂对照组、si-NC+抑制剂组和si-Kcnq1ot1+抑制剂组。采用qRT-PCR检测Kcnq1ot1、miR-92a-1-5p和胰岛素转录本1（ Ins1）、胰岛素转录本2（ Ins2）、胰岛素受体（ Insr）、NK6同源盒蛋白1（ Nkx6.1）、胰岛素受体底物1（ Irs1）和神经生成素3（ Ngn3）mRNA水平；Western blotting检测胰岛素和Insr蛋白表达水平；葡萄糖刺激胰岛素释放实验检测胰岛素分泌水平；双荧光素酶报告基因实验验证Kcnq1ot1与miR-92a-1-5p之间的直接作用关系。各组间指标的差异比较采用独立样本 t检验、方差分析，采用Pearson相关分析法分析受试者Kcnq1ot1表达量与FPG和HbA 1c的相关性。 结果:T2DM患者血清中Kcnq1ot1的表达量较对照组显著下调（ P<0.01），且Kcnq1ot1的表达量与FPG和HbA 1c呈负相关关系（ r=-0.52、-0.49，均 P<0.05）。与CD组相比，HFD组小鼠胰岛中Kcnq1ot1表达量下调（ P<0.001）。在Min6细胞中，与BSA组相比，PA组细胞中Kcnq1ot1表达量下调（ P<0.01）；与si-NC组相比，si-Kcnq1ot1组葡萄糖刺激的胰岛素分泌降低（ P<0.05），且 Ins1、 Ins2、 Insr、 Nkx6.1、 Irs1和 Ngn3的mRNA水平及Insr和胰岛素的蛋白水平均降低（ P<0.05）；与模拟物对照组相比，模拟物组葡萄糖刺激的胰岛素分泌降低（ P<0.05），且 Ins1、 Ins2、 Insr、 Nkx6.1、 Irs1和 Ngn3的mRNA水平及Insr和胰岛素的蛋白水平均降低（ P<0.05）；与抑制剂对照组相比，抑制剂组葡萄糖刺激的胰岛素分泌水平升高（ P<0.05），且 Ins1、 Ins2、 Insr、 Nkx6.1、 Irs1和 Ngn3的mRNA水平及Insr和胰岛素的蛋白水平均升高（ P<0.05）。双荧光素酶报告实验显示，模拟物和Kcnq1ot1-WT质粒共转染细胞后，Kcnq1ot1-WT荧光素酶活性降低（ P<0.05）；抑制剂和Kcnq1ot1-WT质粒共转染细胞后，Kcnq1ot1-WT的荧光素酶活性显著升高（ P<0.05）。与si-NC组相比，si-Kcnq1ot1组miR-92a-1-5p表达升高（ P<0.05）；与si-Kcnq1ot1+抑制剂对照组相比，si-Kcnq1ot1+抑制剂组Min6细胞中的 Ins1、 Ins2、 Insr、 Irs1和 Ngn3转录水平及胰岛素和Insr的蛋白水平升高（ P<0.05）。 结论:长链非编码RNA Kcnq1ot1可能通过靶向调控miR-92a-1-5p影响胰岛β细胞功能。

目的:胰升糖素样肽1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)、胃泌素协同促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)转分化的胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells, IPCs)分化。方法:(1)制备IPCs模型：胰十二指肠同源盒1(pancreatic duodenal homeobox 1, Pdx-1)、神经元素3(neurogenin 3, Ngn3)联合V型肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源基因A(V-type tendon fibrosarcoma oncogene homolog A, MafA)共转染BMSCs转分化为IPCs；(2)IPCs分为4组：A组，未诱导组；B组，GLP-1诱导组；C组，胃泌素诱导组；D组，GLP-1联合胃泌素诱导组，高糖培养基培养7 d，RT-PCR检测各组胰岛素2(insulin2)、葡萄糖激酶(GK)、巢蛋白(nestin)、胰升糖素(glucagon)及Pdx-1表达水平，ELISA检测各组胰岛素分泌情况。结果:在高糖条件下培养7 d，各组IPCs形态出现明显变化，逐渐聚集并形成散在细胞团块，联合诱导组形成大型细胞团块，双硫棕染色呈红棕色；各组在诱导第0、3、5、7、9天胰岛素分泌水平逐渐提高，且联合诱导组升高最为明显( P<0.05)；与A组相比，B、D组Insulin2和GK表达明显上调，D组glucagon表达下调，C组Pdx-1表达下调，glucagon表达上调，( P<0.05)；与B组相比，C组insulin2表达下调，glucagon表达水平明显上调，D组insulin2和GK表达水平明显上调，glucagon表达水平下调( P<0.05)；与C组相比，D组Pdx-1、insulin2和GK表达水平明显上调，glucagon表达水平下调( P<0.05)。 结论:GLP-1和胃泌素通过上调insulin2和GK，下调glucagon协同促进IPCs向胰岛β细胞分化。

目的 基于小窝蛋白1(caveolin-1,Cav1)/音猬因子(sonic hedgehog,Shh)信号通路探讨补阳还五汤对脑缺血后星形胶质细胞转分化的作用机制.方法 雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组及补阳还五汤低、中、高剂量(9.25、18.50、39.00 g/kg)组和丁苯酞(54mg/kg)组,除假手术组外,其余各组采用大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)法复制脑缺血模型,给予药物干预21 d后,采用神经行为学评分、苏木素-伊红染色及免疫组化评估补阳还五汤疗效.随后将雄性野生(WT)小鼠及Cav1-/-(KO)小鼠分别随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤(18.5g/kg)组,造模前7d予以脑内注射GFAP-EGFP腺相关病毒,采用MCAO法制备脑缺血模型,给予药物干预21 d.采用免疫荧光检测缺血侧皮质区星形胶质细胞转分化情况,Western blotting法检测缺血侧皮质区Shh、平滑同源物(smootened,Smo)及神经胶质瘤关联癌基因同源物1(glioma associated oncogene homolog 1,Gli1)的蛋白表达,qRT-PCR法检测神经分化因子acoete-scute同系物 1(achaete-scute complex homolog 1,Ascl1)、神经源性分化因子 1(neurogenic differentiation 1,NeuroD1)、神经源性分化因子 2(neurogenic differentiation 2,NeuroD2)、神经元素 1(neurogenin-1,Ngn1)、神经元素 2(neurogenin-2,Ngn2)及配对盒基因2(paired box gene 2,Pax2)的表达.结果 与模型组比较,补阳还五汤各剂量组及丁苯酞组的神经行为学评分显著降低(P＜0.05、0.01),缺血侧皮质区病理损伤明显改善,NeuN表达明显上升(P＜0.05、0.01).此外,补阳还五汤低剂量组和补阳还五汤中剂量组的神经行为学评分及NeuN的表达有显著差异(P＜0.01),而补阳还五汤中、高剂量组及丁苯酞组之间无明显差异.与同基因型模型组比较,WT、KO补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质区EGFP-NeuN共定位明显增加(P＜0.01),Shh、Smo 及 Gli1 蛋白表达明显上升(P＜0.05、0.01),神经分化因子 Ascl1、NeuroD1、NeuroD2、Ngn1、Ngn2及Pax2表达明显上升(P＜0.05、0.01).与WT模型组及WT补阳还五汤组比较,KO模型组及KO补阳还五汤组小鼠缺血侧皮质EGFP-NeuN共定位明显下降(P＜0.01),Shh、Smo及Gli1蛋白表达明显下降(P＜0.05),神经分化因子Ascl1、NeuroD1、NeuroD2、Ngn1、Ngn2及Pax2表达明显下降(P＜0.05、0.01).结论 补阳还五汤能够促进脑缺血后星形胶质细胞向神经元转分化,其作用机制可能与通过Cav1调控Shh信号通路,上调各神经分化因子的表达有关.

目的:观察有氧运动后阿尔茨海默病(AD)小鼠大脑Notch信号通路相关因子表达及甲基化水平的变化,探究有氧运动如何影响AD小鼠Notch信号通路.方法:将3月龄APP/PS1双转基因AD小鼠随机分为两组:对照组(ADC组),运动组(ADE组),每组20只.对照组不进行运动,运动组进行每周5天、每天30min、持续5个月的跑台运动干预.干预5个月后取小鼠脑组织,采用Real-time PCR、免疫荧光及Western Blot技术分别检测海马组织Notch1、Hes1及神经元素2(Neurogenin2,Ngn2)蛋白和mRNA的表达,采用甲基化特异性PCR检测海马组织Notch1、Hes1、Ngn2的甲基化水平.结果:与ADC组相比,ADE组小鼠大脑海马组织Notch1、Hes1蛋白和mRNA表达显著降低(P<0.01),海马DG区Notch1阳性细胞数量、Hes1阳性细胞数量显著降低(P<0.01),Hes1免疫阳性产物荧光强度显著降低(P<0.05);而ADE组小鼠海马Ngn2蛋白和mRNA表达显著升高(P<0.05),海马DG区Ngn2阳性细胞数量显著升高(P<0.01),Ngn2免疫阳性产物荧光强度显著升高(P<0.05).通过甲基化特异性PCR检测发现,与ADC组相比,ADE组小鼠海马Notch1及Hes1的甲基化率显著增加,Ngn2的甲基化率则显著减少(P<0.01).结论:长期有氧运动后AD小鼠海马Notch1及Hes1的甲基化率显著增加,而其Ngn2的甲基化率则显著减少,而这可能是长期有氧运动可以显著下调AD小鼠海马Notch1、Hes1的表达,以及显著上调Ngn2表达的原因之一.

背景:研究显示,血红素氧化酶1(heme oxidase-1,HO-1)在脑缺血再灌注损伤中具有重要作用;核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid2-related factor2,Nrf2)能减轻脑缺血再灌注损伤,其作用是通过调控下游抗氧化蛋白实现的;推测Nrf2/HO-1在脑部疾病中均有一定的调控作用.目的:探究神经源素2(neurogenin 2,Ngn2)通过调节Nrf2/HO-1对脑缺血大鼠脑微结构、角质细胞活性的影响.方法:SPF级雄性SD大鼠55只,随机取10只为健康组不进行干预;其余大鼠建立脑缺血模型,将建模成功的40只大鼠随机分为4组:其中模型组大鼠脑内注射生理盐水;Ngn2组大鼠脑内注射Ngn210 mg/kg;Nrf2/HO-1组脑内注射HO-1及Nrf2激动剂莱菔硫烷各10 mg/kg;联合调节组脑内注射Ngn2并联合Nrf2/HO-1组用药,均连续给药3 d.分数各向异性图像观察脑微结构,苏木精-伊红染色观察脑组织的病理形态,TUNEL法检测神经胶质细胞凋亡,免疫印迹和PCR分别检测Nrf2、HO-1的蛋白及mRNA表达.结果 与结论:①与健康组比较,模型组大鼠脑组织中梗死灶周围皮质、梗死核心相对分数各向异性值表达较低(P<0.05);与模型组比较,Ngn2组及Nrf2/HO-1组上述表达升高(P<0.05);联合调节组上述表达高于Ngn2组及Nrf2/HO-1组(P<0.05);②模型组大鼠大量损伤神经元,细胞稀疏,排列紊乱,大量浸润;Ngn2组与Nrf2/HO-1组损伤侧神经元好转,仍见神经细胞缺失紊乱及细胞黏附;联合调节组脑组织神经细胞坏死减轻,浸润改善;③与健康组比较,模型组大鼠神经胶质细胞凋亡较高(P<0.05);与模型组比较,Ngn2组及Nrf2/HO-1组神经胶质细胞凋亡降低(P<0.05);联合调节组神经胶质细胞凋亡低于Ngn2组及Nrf2/HO-1组(P<0.05);④与健康组比较,模型组大鼠脑组织Ngn2 mRNA及Nrf2、HO-1的蛋白和mRNA表达较低(P<0.05);与模型组比较,Ngn2组、Nrf2/HO-1组Ngn2 mRNA及Nrf2、HO-1的蛋白和mRNA表达升高(P<0.05);联合调节组Ngn2 mRNA及Nrf2、HO-1的蛋白和mRNA表达高于Ngn2组及Nrf2/HO-1组(P<0.05);⑤结果说明,Ngn2通过调节Nrf2/HO-1对脑缺血大鼠产生保护作用,其机制可能与改善脑微结构、角质细胞活性以及增强Nrf2、HO-1表达等具有一定相关性.

目的 研究左归降糖解郁方调控模拟糖尿病并发抑郁症脑环境下的体外海马神经干细胞增殖与分化作用及分子机制.方法 纯化和培养SD大鼠海马神经干细胞并通过标记巢蛋白(Nestin)进行荧光鉴定.取第3代海马神经干细胞进行实验,分为正常组、模型组、空白血清组、左归降糖解郁方含药血清组、左归降糖解郁方含药血清+海马无翅基因3a(recombinant wingless type MMTV integration site family member 3a,Wnt3a)信号抑制剂 XAV-939 组.在干细胞培养液中添加葡萄糖和皮质酮模拟糖尿病并发抑郁症脑环境进行造模,空白血清组和左归降糖解郁方含药血清组于造模同期分别给予不同血清.干预18 h后,采用WST-1检测干细胞活力,采用Brdu免疫荧光结合高内涵细胞成像技术评价干细胞的增殖能力,分别采用双皮质素(doublecortin,DCX)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、神经元核抗原(neuron specific nuclear protein,NeuN)免疫荧光评估干细胞的分化能力,采用Western blotting检测各组细胞Wnt3a、低密度脂蛋白受体相关蛋白 5(low density lipoprotein receptor-related protein 5,LRP5)、LRP6、β-连环蛋白(β-catenin)表达,采用 qRT-PCR法检测神经原素2(neurogenin 2,Ngn2)、细胞周期蛋白(cyclinD1)基因表达.结果 左归降糖解郁方能显著增加受损海马神经干细胞的活力(P＜0.01),增加Brdu、DCX、GFAP、NeuN的表达(P＜0.01),增强其增殖和分化的能力.机制研究发现,左归降糖解郁方能显著增加神经干细胞中的Wnt3a、LRP5、LRP6、总β-catenin、核β-catenin蛋白的表达(P＜0.05、0.01),激活Wnt3a信号并增加β-catenin的蓄积和入核,从而促进下游Ngn2、cyclinD1靶基因的转录(P＜0.05、0.01).XAV-939可通过增加β-catenin的降解(P＜0.01),减少其进入细胞核,减少下游Ngn2、cyclinD1的mRNA转录(P＜0.05、0.01),从而降低干细胞的增殖与分化能力.结论 左归降糖解郁方能明显改善葡萄糖与皮质酮对体外海马神经干细胞增殖与分化的抑制作用,其改善作用与激活Wnt3a/β-catenin信号有关.

目的 探讨Notch信号通路在胎儿酒精谱系障碍(FASD)斑马鱼模型的神经元分化及及感觉-运动能力中的作用.方法 首先,将斑马鱼胚胎分为二甲基亚砜(DMSO)组和50 μmol/L氮-[氮-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-S-苯基甘氨酸丁酯(DAPT,Notch信号通路抑制剂)处理组,检测比较两组斑马鱼的死亡率、孵化率以及畸形率;比较两组斑马鱼的身体长度;利用原位杂交和qRT-PCR技术检测两组神经干/前体细胞标志物sox2、神经前体细胞分化因子neurogenin1、神经元标志物huc的表达;检测两组在无刺激、强光、震动刺激情况下的行为学表现.其次,将斑马鱼胚胎分为DMSO组、1.5%酒精处理组、DAPT处理组、酒精和DAPT联合处理组,利用原位杂交和qRT-PCR技术检测各组sox2、neurogenin1、huc的表达,检测Notch信号通路相关基因(Notch信号受体notch1a,促进神经发育的靶基因her8a及Notch胞内活性片段(NICD)的mRNA表达水平;检测各组在无刺激、强光、震动刺激情况下的行为学表现.结果 50 μmol/L DAPT处理斑马鱼胚胎后,受精后1d(1dpf)胚胎死亡率(P<0.01)显著增加,2 dpf孵化率显著降低(P<0.01),3 dpf畸形率(P<0.001)显著增加,15 dpf斑马鱼体长显著缩短(P<0.05);斑马鱼胚胎sox2表达水平显著降低(P<0.01),neurogenin1(P<0.05)和hucmRNA(P<0.01)表达水平显著增加;在无刺激、强光、震动刺激情况下,DAPT处理组的斑马鱼运动距离均显著缩短(P<0.001),运动速度均显著降低(P<0.05).单独使用1.5%酒精处理斑马鱼胚胎后,notch1a、her8a及NICD的mRNA表达水平显著升高(P<0.05);1.5%酒精联合DAPT处理斑马鱼胚胎后,较酒精单独处理组,neurogenin1和hucmRNA表达水平显著增加,sox2 mRNA表达水平显著降低(P<0.01),在强光刺激下的运动距离显著变长,运动速度显著变快(P<0.05).结论 酒精上调斑马鱼胚胎Notch信号、抑制神经元分化并降低感觉-运动能力,而抑制Notch信号通路可改善斑马鱼胚胎神经元分化及感觉-运动能力.