目的:通过对比分析结核分枝杆菌潜伏感染(latent tuberculosis infection,LTBI)者和健康人的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)经结核特异性抗原刺激后的转录组,寻找LTBI人群中结核抗原特异的免疫应答重要基因及可能发挥功能的信号通路,绘制LTBI基因表达谱.方法:应用微阵列芯片检测2009年12月在首都医科大学附属北京胸科医院招募的4例LTBI者(LTBI组)和4名健康人(健康对照组)经结核抗原刺激后的PBMC转录组,并对部分差异基因进行qPCR检测以验证芯片数据.应用加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)筛选与LTBI最相关模块,并对模块中的基因分别进行基因本体论(geneontology,GO)分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto encylopedia of genes and genomes,KEGG)通路分析.通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)从全转录组水平筛选信号通路.通过免疫浸润分析寻找与LTBI相关的免疫细胞.通过STRING数据库蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络分析绘制两模块中差异基因相互作用网络图.结果:LTBI组与健康对照组间共发现393个差异表达基因(差异倍数＞2或＜0.5,P＜0.05),LTBI中112个表达下调,281个表达上调.针对10个差异基因的实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)检测证实基因表达趋势与芯片数据一致,即CAMK1G、IL2、SPINK1、SUCNR1、HCAR3、IL18BP、CHI3L1、TNF 均上调;RASGRP2、TPM2 均下调.通过 WGCNA 分析确定与 LTBI 最相关的正相关蓝色模块(cor=0.88,P=0.004)和负相关蓝绿色模块(cor=-0.93,P=0.001).对上述模块内基因进行KEGG富集分析,并行基于全转录组的GSEA分析,发现趋化因子信号通路(P＜0.001)和凋亡信号通路(P=0.003)在两种分析中均明显富集.对两模块中的差异基因通过STRING数据库构建PPI网络图,通过内置插件计算得到每个模块中的前10个关键基因,即蓝色模块中的PTPRC、CD40、IL10、IRF8、CCR1、CD80、TLR8、CLEC7A、CD83 和 CD274;蓝绿色模块中的 TNF、ICAM1、TNFRSF4、HAVCR2、CD276、CCL4、CD33、IL1RN、NCF1和FGR.免疫浸润分析发现,M1型巨噬细胞(P=0.029)和M2型巨噬细胞(P=0.001)等固有免疫细胞的比例在LTBI组和健康对照组间存在明显差异.结论:经结核特异性抗原刺激后的PBMC转录组在LTBI人群和健康人群间存在明显差异,这些差异基因主要聚集于凋亡信号通路和趋化因子信号通路,其中巨噬细胞介导的免疫应答在其中发挥了重要作用,揭示了固有免疫应答在LTBI中的重要作用.

目的 观察IVF-ET技术对早期胎盘滋养层细胞MAPK信号通路基因表达的影响,探讨IVF-ET技术对早期胎盘发育和功能的影响. 方法 IVF-ET周期中双胚胎移植后妊娠7～8周,经超声引导下减胎获得的胎盘绒毛组织作为研究组(IVF-ET组,28例),自然妊娠双胎7～8周人工流产中获得的胎盘绒毛组织作为对照组(8例).利用AffymetrixHG-U133 Plus 2.0基因芯片对两组胎盘绒毛组织进行芯片杂交分析.用定量反转录聚合酶链反应(qRT PCR)在两组胎盘绒毛组织中验证其中的8个差异表达基因,从基因芯片数据中选取差异表达基因进行无监督聚类分析和基因本体(GO)功能生物信息学分析. 结果 与对照组相比,IVF-ET早期胎盘MAPK信号通路有32个差异表达基因(差异倍数≥2倍),13个基因上调,19个基因下调.上调基因是PLA2G12B、JUN、RPS6KA3、ACVR1B、FGF 18、PRKACB、RASGRP3、PLA2G4A、FGFR4、PDGFRA、CACNB2、RPS6KA2和SOS1,下调基因是STK4、GNG12、MAPK9、DUSP16、IL1R2、MAP3K8、BRAF、STK3、HSPA2、HSPB1、DUSP4、EGFR、IL1R1、TGFB1、RASA1、RPS6KA5、GADD45G、PLA2G2A和DUSP5.经qRT-PCR检测,与对照组相比,IVF-ET组8个MAPK信号通路基因成员中JUN、PLA2G4A、PDGFRA和SOS1上调,MAPK9、EGFR、TGFB1和GADD45G下调,与基因芯片检测结果一致.MAPK信号通路基因定位显示,IVF-ET组胎盘绒毛组织中受到影响的基因主要位于MAPK信号通路的上游. 结论 IVF-ET来源的早期胎盘MAPK信号通路基因表达与自然妊娠早期胎盘中存在差异,差异的基因涉及MAPK信号通路的多种关键功能,进而可能影响IVF-ET胎盘早期发育和功能.

目的 报告一个遗传性血小板功能障碍家系并探索其分子发病机制.方法 收集该家系临床资料,采用二代高通量测序法进行遗传性血液病和血小板功能相关近600种基因突变筛查.采用RT-PCR及一代测序法检测先证者及其父母RASGRP2基因部分转录本序列.结果 该遗传性血小板功能障碍家系临床表现符合变异型血小板无力症,表现为反复皮肤黏膜严重出血,先证者血小板对多种不同浓度的生理性诱聚剂反应低下甚至缺如.先证者未检出整合素αⅡbβ3基因突变,而存在RASGRP2 IVS3-1C＞G纯合突变,其父母均为该位点杂合突变.先证者在扩增区检测出2种转录本,功能型RASGRP2蛋白对应的正常转录本未检出,其父母同时存在正常转录本及异常转录本,但以正常转录本为主.结论 RASGRP2基因IVS3-1C＞G纯合突变是导致该家系先证者发生血小板功能障碍性出血的原因.RASGRP2基因IVS3-1C＞G突变导致RASGRP2异常剪接,发挥激活Rap1的RASGRP2蛋白缺失,进而导致血小板功能障碍.本研究为国内首次报道RASGRP2基因异常导致血小板功能障碍性出血,也是国际上首次报道该突变类型.

目的 探讨Ras鸟苷酸释放蛋白4(RasGRP4)是否直接参与自然杀伤细胞(NK细胞)调控干扰素-γ的分泌.方法 以RasGRP4基因敲除小鼠和C57BL/6野生型小鼠为研究对象,共24只.根据随机数字法随机分为C57 BL/6+生理盐水组、C57BL/6+脂多糖组、RasGRP4-/-+生理盐水组、RasGRP4-/-+脂多糖组,每组6只小鼠.采用流式细胞术微球阵列法分析两种小鼠在脂多糖免疫激活状态下血清干扰素-γ等免疫炎性因子水平;采用流式细胞术探讨RasGRP4基因敲除对小鼠外周血和脾细胞中主要干扰素-γ分泌细胞(NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞)比例的影响,以及在脂多糖激活2.5h时干扰素-γ+NK细胞、干扰素-γ+CD4+T细胞、干扰素-γ+CD8+T细胞的比例;分别提纯两种小鼠的NK细胞,比较其在脂多糖体外激活下干扰素-γ分泌能力.结果 与C57BI/6+生理盐水组和RasGRP4-/-+生理盐水组相比,C57BL/6+脂多糖组和RasGRP4-/-+脂多糖组白细胞介素(IL)-12p70、IL-10、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1、IL-6、干扰素-γ较脂多糖激活前均显著升高(t ＝2.823 7～6.310 3,P均＜0.01).RasGRP4-/-+脂多糖组血清中干扰素-γ水平约是C57BL/6+脂多糖组的20％(t＝5.546 1,P＜0.01);尽管C57BL/6+生理盐水组和RasGRP4-/-+生理盐水组外周血、脾细胞中NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞的比例差异均无统计学意义(P均＞0.05),但在脂多糖激活状态下,RasGRP4-/-+脂多糖组外周血干扰素-γ+的NK1.1细胞比例仅为C57BL/6+脂多糖组的30％(t＝8.011 2,P＜0.01);而脾脏细胞中干扰素-γ+NK1.1的比例约为C57BL/6+脂多糖组的50％(t＝4.429 2,P＜0.01).在体外实验中,RasGRP4-/-来源的NK细胞在脂多糖刺激下细胞上清中干扰素-γ的水平为C57BL/6来源的30％(t＝5.522 8,P＜0.01).结论 RasGRP4在NK细胞分泌干扰素-γ的过程中起重要调控作用.

[目的]在GT1-7细胞过表达LIN28A,研究其与性发育相关基因表达是否存在调控关系;RNA-seq发现LIN28A参与调控性发育的信号通路和基因.[方法]构建LIN28A慢病毒过表达载体,转染GT1-7细胞,Real-Time PCR检测LIN28A和性发育相关基因在mRNA水平表达变化;将过表达LIN28A的GT1-7细胞进行RNA-seq、生物信息学分析、Real-Time PCR验证,找到影响性发育的信号通路和基因.[结果]与对照相比,HN28A在GT1-7细胞过表达18倍(P＜0.001),KISS1在mRNA水平显著升高(P＜0.01);KEGG分析,LIN28A相关的差异基因在MAPK信号通路差异显著,MAPK通路筛选到多个性发育相关基因(Ff21、JUN、Cyplal、Rasgrp2),Real-Time PCR验证它们在mRNA水平差异显著(P＜0.05).[结论]成功构建LIN28A慢病毒过表达载体,LIN28A在GT1-7细胞中过表达会促进KISS1的表达,并且LIN28A可能通过MAPK通路调控性发育.

目的:研究白花蛇舌草(Hedyotis diffusa Willd,HDW)对人肾癌细胞增殖、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭的影响,并探讨其可能的作用机制.方法:人肾细胞腺癌ACHN和人肾近曲小管HK-2细胞经HDW处理24h后,采用CCK-8法检测HDW对ACHN和HK-2细胞增殖的影响,FCM法检测HDW对细胞周期和凋亡的影响.光学显微镜下及罗丹明染色法观察HDW处理对ACHN和HK-2细胞形态的影响;采用免疫荧光染色法和蛋白质印迹法检测间质-上皮转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)相关蛋白表达的变化.划痕愈合实验和Transwell小室法检测ACHN和HK-2细胞的迁移和侵袭能力,RNA测序法检测HDW对ACHN细胞转录组的影响;实时荧光定量PCR法检测RAP1信号通路相关基因RAP1GAP、RASGRP2、RAPGEF3、MAGI1及GNAI1 mRNA的表达水平;蛋白质印迹法检测丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activate protein kinase,MAPK)通路相关蛋白c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK (phospho-JNK,p-JNK)、蛋白激酶B(protein kinaseB,PKB,又称Akt)、磷酸化Akt (phospho-Akt,p-Akt)、细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和磷酸化ERK (phospho-ERK,p-ERK)表达水平的改变.结果:HDW可选择性抑制ACHN细胞增殖(P＜0.01),将细胞周期阻滞于S期(P＜0.01),诱导细胞凋亡(P＜0.01).HDW处理后ACHN细胞的形态发生了明显变化,HDW可促进ACHN细胞中E-钙黏蛋白1 (E-cadherin 1)和β-连环蛋白(β-catenin)的表达,并抑制波形蛋白(Vimentin)和Snail1的表达(P值均＜0.01).HDW能显著抑制细胞的迁移和侵袭能力(P值均＜ 0.01),且ACHN和HK-2细胞之间没有明显差异.RNA测序结果分析显示,HDW可影响细胞周期相关基因以及控制细胞生长的转录因子E2F和Myc靶基因的表达,并激活p53信号通路;HDW可显著下调ACHN细胞中RAP1GAP、RASGRP2、RAPGEF3、MAGI1及GNAI1 mRNA (P值均＜0.000 1)和p-JNK蛋白的表达水平.结论:HDW可能通过抑制RAP1-JNK信号通路来选择性抑制肾癌细胞ACHN的增殖,促进ACHN细胞MET、周期阻滞和凋亡.

遗传性血小板功能障碍(inherited platelet function disorders ,IPFD)是一种多伴常染色体遗传的罕见出血性疾病,儿童多见,典型表现为不同程度的出血,以皮肤黏膜出血、月经过多、外伤后难以止血多见,伴或不伴血小板减少[1 ].

背景与目的 肺癌是全球发病率和死亡率的居高不下的恶性肿瘤.近年来,随着新型药物的出现和治疗模式的优化,特别是免疫治疗在临床的应用,肺癌患者的预后已经有了一定的改善.但免疫治疗获益的患者仍然有限,因此我们想要寻找新的生物标志物用于预测肺腺癌患者的预后并探索其对免疫微环境的影响.方法 使用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库下载肺腺癌患者的测序结果及临床资料.利用人类蛋白质图谱数据库明确RASGRP2在肺腺癌中分布情况,使用Kaplan-Meier Plotter数据库探索RASGRP2表达情况与肺腺癌患者预后之间的联系.对RASGRP2高低表达患者进行KEGG及GO基因富集分析.使用TCGA数据库分析RASGRP2共表达基因并使用TIMER数据库计算RASGRP2及其共表达基因的免疫相关淋巴浸润情况.最后使用TIMER 2.0数据库分析RASGRP2表达量与免疫检查点表达的联系.结果 RASGRP2在肺腺癌中低表达,与患者预后密切相关.RASGRP2高表达参与造血细胞形成及细胞黏附,且在T细胞活化进程中有着重要作用.通过TCGA数据库分析发现ZAP70、TBC1D10C、RASAL3、FGD2、CD37、ACAP1与RASGRP2显著相关.以上基因高表达会引起CD8+T细胞、记忆CD4+T细胞比例升高以及中性粒细胞和Treg细胞比例降低.最后,我们发现RASGRP2表达量与常见免疫检查点CD274、CTLA4、LAG3、TIGIT等表达量显著相关.结论 RASGRP2在肺腺癌中异常表达且影响免疫相关细胞浸润水平,可能会影响免疫治疗疗效.

噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH)是由于机体免疫功能失控,形成HLH致命的炎症因子风暴表现.随着分子遗传学研究的发展,目前,对于HLH的认识逐渐深入.其中,一些基因突变在引起HLH过程中,EBV感染为其重要诱因,这类疾病被称为EB病毒驱动型噬血细胞性淋巴组织细胞增多症.目前已知基因包括IL-2诱导的T细胞激酶缺乏(ITK)缺陷、镁离子转运体1(MAGT1)缺陷、CD27缺陷、CD70缺陷、CTPS1缺陷以及RASGRP1缺陷.本文将对EB病毒驱动型噬血细胞性淋巴组织细胞增多症的流行病学、病理生理机制、临床表现、治疗进行综述.