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基于实时细胞分析技术的中药挥发性组分抗人腺病毒3型毒/效整合评价的高通量筛选新策略
编辑人员丨4天前
目的 基于实时细胞分析(real time cell analysis,RTCA)技术对中药挥发性组分的细胞毒性及抗人腺病毒3型(human adenovirus 3,HAdV-3)的作用进行毒/效整合分析,构建抗病毒药物高通量筛选的新策略.方法 采用RTCA技术动态监测不同接种密度的A549细胞48 h生长曲线及10倍梯度稀释的HAdV-3感染A549细胞生长曲线,获得A549细胞最佳接种密度及HAdV-3最佳稀释浓度用于后续实验.以利巴韦林为阳性对照,基于RTCA技术采用曲线下面积(Area Under the Curve,AUC)方法对5种中药挥发性组分的细胞毒性及抗HAdV-3的作用进行毒/效整合分析,并与传统终点法数据处理进行对比.结果 终点法中艾叶、柴胡、薄荷、荆芥、牛蒡子、酸枣仁和利巴韦林对细胞的保护率分别为0.73%、12.50%、20.99%、44.50%、27.99%、51.50%和 82.70%;AUC 法中艾叶、柴胡、薄荷的选择性指数(Selective In-dex,SI)为负数,分别为-0.57、-0.21和-0.08.荆芥、牛蒡子、酸枣仁和利巴韦林的SI值分别为0.14、0.40、0.72和5.33.以利巴韦林的抗病毒活性为参照,终点法中酸枣仁、牛蒡子和荆芥的抗病毒活性为利巴韦林抗病毒活性的62.27%、33.85%和53.81%;AUC法中酸枣仁、牛蒡子和荆芥的抗病毒活性为利巴韦林抗病毒活性的13.51%、7.50%和2.63%.结论 传统终点法与研究采用的AUC法计算结果有较大的差异.传统的抗病毒活性筛选研究多采用终点法检测受试药物对病毒感染细胞的保护作用,无法反映整个感染周期的变化,缺乏细胞毒的数据也会对结果的判断产生偏差.研究提示基于RTCA技术对中药挥发性组分开展抗HAdV-3的毒/效整合评价,采用AUC方法计算药物的选择性指数作为高通量筛选新策略,能快速、精准地判断受试药物的抗病毒活性,具有准确性高、重复性好的优势.
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编辑人员丨4天前
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表达荧光素酶的胰腺癌细胞系的建立及其在免疫细胞杀伤效力检测中的应用
编辑人员丨4天前
目的:构建表达报告基因荧光素酶和肿瘤相关抗原间皮素(mesothelin,MSLN)基因的胰腺癌细胞系,评估其作为靶细胞在评价免疫细胞的肿瘤杀伤效力中的应用。方法:构建表达荧光素酶、MSLN基因的慢病毒载体,包装慢病毒,感染胰腺癌细胞系,抗生素筛选后,有限稀释法获得单细胞克隆,并验证目的基因的稳定表达。实时无标记细胞分析(real-time cell analysis,RTCA)和荧光素酶活性检测方法体外检测免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤效力。将构建的细胞系接种B-NDG小鼠建立表达荧光素酶的胰腺癌肿瘤模型,利用活体成像技术检测荧光素酶表达水平,监测小鼠体内胰腺癌肿瘤生长情况。在胰腺癌小鼠模型中验证嵌合抗原受体T(chimeric antigen receptor T,CAR-T)细胞的肿瘤杀伤能力。结果:本研究建立了稳定表达荧光素酶和MSLN基因的胰腺癌细胞系panc-1-luc、panc-1-luc-MSLN和capan-2-luc细胞。3种细胞的报告基因表达水平较高,与细胞数量呈正相关,panc-1-luc-MSLN细胞的MSLN阳性率达95.6%。体外肿瘤细胞杀伤试验结果表明MSLN-CAR-T细胞能特异性杀伤MSLN抗原阳性的panc-1-luc-MSLN细胞和capan-2-luc细胞,最小杀伤率分别为(70.00±18.19)%和(57.00±5.29)%,而对MSLN阴性的panc-1-luc细胞无杀伤作用。RTCA结果显示MSLN-CAR-T细胞对构建的3种胰腺癌细胞均有杀伤能力,最小杀伤率分别为(56.33±7.64)%、(93.00±2.65)%和(26.33±28.15)%;NK-92MI细胞对靶细胞的杀伤不受MSLN限制。免疫缺陷小鼠胰腺癌模型结果显示,体内杀伤效力与体外荧光素酶活性检测结果一致。体内外试验证明,检测靶细胞荧光素酶表达活性,可以反映免疫细胞对靶细胞的杀伤效力。结论:本研究建立了稳定表达荧光素酶的多株胰腺癌单克隆细胞系,可用于体内外免疫治疗产品肿瘤杀伤效力的研究评价。
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编辑人员丨4天前
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IL-6通过促进人胎盘间充质干细胞上CD73的表达调节其迁移、黏附和增殖能力
编辑人员丨4天前
目的:探讨IL-6影响人胎盘间充质干细胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells,hPMSCs)表面CD73的表达,以及调节其迁移、黏附和增殖的作用机制。方法:流式细胞术(flow cytometry,FCM)和Western blot分析外源性IL-6和hPMSCs分泌的IL-6对hPMSCs上CD73表达的影响。单克隆抗体阻断和Western blot方法检测IL-6对hPMSCs中信号转导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)磷酸化的影响。实时无标记动态细胞分析技术(real-time cellular analysis, RTCA)分析慢病毒转染后低表达CD73的hPMSCs和APCP(5′-α,β亚甲基-二磷酸腺苷)预处理后hPMSCs的迁移、黏附和增殖变化。结果:FCM与Western blot检测结果显示,外源性和hPMSCs分泌的IL-6均能促进CD73在hPMSCs上的表达( P<0.001, P<0.01)。IL-6R抑制剂处理后,hPMSCs上CD73表达明显下降( P<0.01);IL-6可上调hPMSCs内STAT3磷酸化和CD73水平( P<0.05, P<0.01),而加入STAT3抑制剂后,CD73表达下降( P<0.01)。RTCA分析结果显示,敲低hPMSCs上CD73的表达后,hPMSCs的黏附和增殖能力均明显降低( P<0.01, P<0.05),迁移能力明显上升( P<0.05)。使用APCP抑制hPMSCs上CD73水解酶活性后,hPMSCs同样表现出黏附和增殖能力明显降低,而迁移能力增强( P<0.05)。 结论:IL-6能够通过JAK/STAT3通路增强hPMSCs上CD73的表达,进而影响其迁移、黏附和增殖能力。
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编辑人员丨4天前
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调控组蛋白H3K27me3水平对砷致肝细胞凋亡过程中BCL2表达的影响
编辑人员丨4天前
目的:探讨在砷诱导肝细胞凋亡过程中,组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)水平对抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2(BCL2)基因表达的影响。方法:体外培养大鼠肝细胞BRL-3A,根据砷处理因素将实验分为两部分,未染砷时分为正常、转染试剂、阴性转染、JMJD3(H3K27me3特异性去甲基化酶)小干扰RNA(siRNA)转染、EZH2(H3K27me3甲基转移酶)siRNA转染组;染砷时分为对照、砷处理、砷+阴性转染、砷+ JMJD3siRNA转染、砷+ EZH2siRNA转染组。未染砷时siRNA和转染试剂按照100 pmol ∶ 7.5 μl比例转染细胞6 h[正常组加入与转染试剂同体积的磷酸盐缓冲液(PBS)],再换培养基培养,共48 h;染砷时同上述方法转染和培养细胞24 h,染砷各组再加入终浓度为30 μmol/L的亚砷酸钠(NaAsO 2)处理24 h(对照组加入与NaAsO 2同体积的PBS处理24 h)。采用实时无标记细胞分析(RTCA)技术动态观察染砷时细胞增殖情况;流式细胞术检测染砷时细胞的凋亡情况;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测未染砷时和染砷时细胞JMJD3、EZH2、H3K27me3、BCL2蛋白表达水平;染色质免疫共沉淀技术检测染砷时细胞BCL2基因启动子区H3K27me3的富集水平。 结果:对照、砷处理、砷+阴性转染、砷+ JMJD3siRNA转染、砷+ EZH2siRNA转染组细胞增殖率分别为(100.00 ± 10.43)%、(12.19 ± 3.37)%、(31.86 ± 1.95)%、(24.58 ± 3.64)%、(11.53 ± 1.11)%,细胞凋亡率分别为(1.15 ± 0.04)%、(13.06 ± 1.33)%、(17.39 ± 0.22)%、(23.90 ± 1.66)%、(15.07 ± 0.88)%,组间比较差异均有统计学意义( F = 146.50、194.30, P均< 0.001)。JMJD3siRNA转染组H3K27me3蛋白表达水平均高于正常、转染试剂、阴性转染组,EZH2siRNA转染组则相反( P均< 0.05);JMJD3siRNA转染组BCL2蛋白表达水平均低于正常、转染试剂、阴性转染组,EZH2siRNA转染组则相反( P均< 0.05),而在正常、转染试剂、阴性转染组之间,H3K27me3、BCL2蛋白表达水平均未见明显改变( P均> 0.05)。在对照、砷处理、砷+阴性转染、砷+ JMJD3siRNA转染、砷+ EZH2siRNA转染组之间,JMJD3、EZH2、H3K27me3、BCL2蛋白表达水平比较,差异均有统计学意义( F = 26.56、7.82、9.81、31.19, P均< 0.05)。与对照组比较,砷处理组JMJD3、EZH2蛋白表达水平均较低,H3K27me3蛋白表达水平较高,同时BCL2蛋白表达水平较低( P均< 0.05);与砷+阴性转染组比较,砷+ JMJD3siRNA转染组JMJD3蛋白表达水平较低,砷+ EZH2siRNA转染组EZH2蛋白表达水平较低,砷+ JMJD3siRNA转染组H3K27me3蛋白表达水平较高,同时BCL2蛋白表达水平较低,而砷+ EZH2siRNA转染组则相反( P均< 0.05)。与对照组比较,砷处理组细胞BCL2基因启动子区(CHIP1、CHIP2)H3K27me3的富集水平均较高( P均< 0.05)。 结论:砷通过增加BCL2基因启动子区H3K27me3的富集水平,进而抑制BCL2的表达,促进肝细胞凋亡。
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编辑人员丨4天前
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基于实时细胞电子分析技术的复方丹参片质量评价研究
编辑人员丨4天前
目的:利用实时细胞电子分析技术(real-time cell-based assay, RTCA)检测不同浓度复方丹参片对细胞的影响,筛选出对复方丹参片反应灵敏、稳定且有明显浓度依赖的细胞株,为复方丹参片进行细胞生物效应的质量评价提供实验依据。方法:采用RTCA分析复方丹参片对人脐静脉内皮细胞(Huvec)、大鼠心肌细胞(H9C2)和大鼠胸主动脉平滑肌细胞(RA-VSMC)的影响,形成时间剂量依赖性细胞反应曲线,测定细胞指数,筛选最优的细胞株。结果:3种细胞对复方丹参片的效应均有明显反应,RA-VSMC的灵敏度相对较差,3种细胞的有效浓度范围也有差异,浓度梯度依赖性也各有不同。H9C2细胞对复方丹参片具有良好的敏感度,呈浓度梯度依赖,且有效浓度范围为0.3~1.8 mg/ml,可作为复方丹参片质量评价的细胞。结论:RTCA技术可实时监测记录细胞生长状态,准确反映复方丹参片对不同细胞株的影响,数据客观可靠,为复方丹参片的质量评价研究提供了新的实验技术和方法。
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编辑人员丨4天前
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肿瘤转移相关基因1对宫颈癌HeLa细胞放疗敏感性的作用及机制
编辑人员丨4天前
目的:探讨肿瘤转移相关基因1(MTA1)对宫颈癌HeLa细胞放疗敏感性的影响及其分子机制。方法:对MTA1敲降的HeLa细胞及对照HeLa细胞进行转录测序,获得差异表达基因并对其进行基因集富集分析和GO聚类分析。采用流式细胞术检测MTA1过表达的HeLa细胞和对照HeLa细胞在10 Gy X射线照射前后的细胞凋亡情况,克隆形成实验和实时无标记动态细胞分析(RTCA)技术检测细胞的增殖情况。选取差异表达基因编码的蛋白构建蛋白相互作用网络,采用免疫荧光实验检测γ-H2AX的表达情况,采用Western blot法检测γ-H2AX、β-CHK2、PARP和cleaved caspase 3的表达水平。结果:转录组测序分析获得差异表达基因649个,其中402个基因在MTA1敲降的HeLa细胞中表达上调,247个基因表达下调。与MTA1相关的差异表达基因富集于DNA损伤修复过程,GO聚类分析提示,DNA损伤修复富集于第2位。流式细胞术检测结果显示,10 Gy X射线照射后,MTA1过表达的HeLa细胞凋亡率[(15.67±0.81)%]低于对照HeLa细胞[(40.27±2.73)%, P<0.001]。RTCA结果显示,过表达MTA1的HeLa细胞经2 Gy X射线照射后,细胞增殖能力高于对照HeLa细胞( P=0.024)。克隆形成实验显示,过表达MTA1的HeLa细胞经2 Gy X射线照射前后的克隆数分别为(176±7)个和(137±7)个,均高于对照细胞[分别为(134±4)个和(75±4)个,均 P<0.05]。免疫荧光实验结果显示,未经X射线照射的MTA1过表达及对照HeLa细胞中的γ-H2AX几乎无表达,经过10 Gy X射线照射后48 h,对照HeLa细胞中可见明显γ-H2AX表达,且MTA1过表达HeLa细胞中γ-H2AX表达相对较低。Western blot结果显示,10 Gy X射线照射后,过表达MTA1的HeLa细胞中β-CHK2的表达水平(1.04±0.06)高于对照HeLa细胞(0.58±0.25, P=0.036),过表达MTA1的HeLa细胞中γ-H2AX、PARP和cleaved caspase 3的表达水平分别为0.52±0.13、0.52±0.22和0.63±0.18,均低于对照HeLa细胞(分别为0.87±0.06,0.78±0.12和0.90±0.12,均 P>0.05)。 结论:过表达MTA1能降低宫颈癌HeLa细胞对X射线的敏感性,MTA1可能通过降低cleaved caspase 3的表达抑制细胞凋亡、增加β-CHK2表达促进DNA修复。
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编辑人员丨4天前
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脂多糖刺激多能干细胞诱导人源心肌细胞与大鼠心肌细胞的体外模型比较
编辑人员丨4天前
目的:比较脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)对多能干细胞诱导的人源心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPS-CMs)及原代新生大鼠心肌细胞(cardiomyocytes,CMs)的影响。方法:不同浓度LPS处理hiPS-CMs和原代新生大鼠CMs 24 ~ 48 h,通过实时无标记细胞分析技术(xCELLigence Real-Time Cell Analyser Cardio system RTCA) 观察hiPS-CMs和原代新生大鼠CMs的电生理变化;qRT-PCR方法检测NPPB mRNA表达水平和qPCR阵列法检测炎性基因表达水平。结果:不同浓度LPS刺激后,原代新生大鼠CMs的电生理变化为搏动频率增加和搏动幅度减少( P<0.01),NPPB mRNA表达水平增加( P<0.01)。在hiPS-CMs中,相对应的LPS浓度刺激未能引起搏动幅度和搏动频率显著变化( P>0.05),NPPB mRNA表达水平未显著增加( P>0.05)。进一步增加浓度(2.5 μg/mL~40 μg/mL),hiPS-CMs的搏动幅度和搏动频率仍未发生明显变化( P>0.05),NPPB mRNA在高浓度LPS(5 μg/mL~40 μg/mL)发生差异性改变( P<0.01)。最后,在炎症相关基因表达方面,原代新生大鼠CMs表现为C3、Gpnmb、Atf3、Il6r和Ly96基因水平上调至1.5倍,hiPS-CMs表现为AK4、TOLLIP、SPP1、FABP1、IL6R、LY96和C3基因水平上调至1.5倍。 结论:与原代新生大鼠CMs相比,hiPS-CMs受到LPS的损伤明显减轻,表现出不同的炎症基因表达模式。
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编辑人员丨4天前
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基于实时细胞分析技术的人诱导多能干细胞源性心肌细胞的药物毒性评价研究
编辑人员丨4天前
目的:以人诱导多能干细胞来源心肌细胞(hiPSC-CMs)为模型,结合实时细胞分析(RTCA)技术建立并验证体外药物心脏毒性评估系统。方法:选用不同浓度的胺碘酮、维拉帕米及多柔比星(阿霉素),分别与商业化来源的hiPSC-CMs孵育,利用RTCA系统实时观察药物作用时及洗脱后不同时间段hiPSC-CMs自主搏动(搏动频率和幅度)、细胞指数及校正的场电位时限(FPDc)变化。结果:1 μmol/L胺碘酮作用12 h后,hiPSC-CMs大部分搏动振幅被抑制;10 μmol/L浓度胺碘酮作用48 h使细胞指数下降12.22%( P<0.05),自主搏动抑制( P<0.001),药物洗脱后未见自主搏动恢复。与对照组相比,100 nmol/L维拉帕米作用12 h使搏动振幅下降47.38%(1.05±0.08对0.55±0.13, P<0.001),FPDc缩短33.33%( P<0.05),在药物洗脱后该组搏动振幅、FPDc恢复;而10 μmol/L维拉帕米作用12 h后搏动振幅完全被抑制,细胞指数下降9.60%( P<0.01),药物洗脱后未见恢复。多柔比星10 nmol/L、100 nmol/L组对各细胞参数无影响,而10 μmol/L组作用12 h后细胞指数下降35.87%( P<0.001),自主搏动、FPDc受到抑制( P<0.001),洗脱后自主搏动未恢复。 结论:以hiPSC-CMs为模型,结合RTCA技术可在体外有效评估不同药物的药理学及毒性,为后续药物早期心脏药理学研究提供方法学参考和理论依据。
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编辑人员丨4天前
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转酮醇酶对结直肠癌细胞增殖及迁移侵袭的影响
编辑人员丨2024/8/10
目的 探讨转酮醇酶(TKT)在结直肠癌中的表达情况以及其对结直肠癌细胞增殖及迁移、侵袭能力的影响.方法 利用定量PCR技术和基于基因表达水平值的交互式分析平台分析TKT在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达情况.使用2种质粒(Ctrl质粒、TKT过表达质粒)分别转染2种结直肠癌细胞株SW480和HCT116,构建过表达TKT稳转细胞株(Ctrl组、TKT-Flag组);通过重组慢病毒技术使用2类RNA(TKT-CtrlRNA、TKT-shRNA)转染上述2种结直肠癌细胞株,构建敲减TKT稳转细胞株(NC组、shTKT组).然后使用蛋白印迹检测过表达TKT和敲减TKT的效果,通过CCK-8、实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)、细胞克隆形成实验分析TKT对结直肠癌细胞增殖的影响.将过表达TKT的HCT116稳转细胞株对裸鼠进行皮下注射,6周后处死小鼠,解剖后取皮下肿瘤组织,通过测量肿瘤体积及质量检测TKT对结直肠癌细胞成瘤能力的影响.通过Transwell实验、划痕实验分析过表达TKT和敲减TKT对上述2种结直肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响.向小鼠尾静脉注射过表达TKT和敲减TKT的HCT116稳转细胞,建立肺转移模型,8周后通过活体成像及H-E染色进一步检测TKT对结直肠癌细胞体内转移的影响.使用Western blot检测过表达TKT和敲减TKT对结直肠癌细胞上皮-间充质转化(EMT)相关蛋白的影响.结果 与癌旁组织相比,结直肠癌组织中TKT表达显著上调,并且在结直肠癌中TKT基因表达量也增高.与Ctrl组相比,TKT-Flag组的TKT蛋白表达上调,结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力提升,EMT相关蛋白Vimentin、N-cadherin和Snail表达水平升高,E-cadherin蛋白下降;与NC组相比,shTKT组的TKT蛋白表达下调,结直肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力明显下降,EMT相关蛋白Vimentin、N-cadherin和Snail表达水平下降,E-cadherin蛋白升高(P<0.05).结论 TKT在结直肠癌中高表达,并且能够增强结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭的能力.
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编辑人员丨2024/8/10
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基于BCMA突变体构建BCMA CAR-T细胞体外杀伤功能评价模型
编辑人员丨2024/7/6
目的:为解决野生型B细胞成熟抗原(BCMA)被γ分泌酶切割导致表达不稳定的问题,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体并构建靶细胞,用于评价BCMA CAR-T细胞的杀伤功能.方法:将野生型BCMA的穿膜域替换为人CD8α穿膜域,构建抵抗γ分泌酶切割的BCMA突变体(BCMA-CD8α TM),构建过表达该突变体的U266(U266BCMA Mut)、K562(K562BCMA Mut)、SKOV3(SKOV3BCMA Mut)和CHO(CHOBCMA Mut)细胞;构建装载NFAT-EGFP报告基因的BCMA CAR Jurkat细胞(BCMA-CAR-Jurkat-Reporter)与U266BCMA Mut细胞共培养,采用FCM检测该细胞中EGFP表达水平以指示NFAT激活水平,荧光素酶法检测BCMA CAR-T细胞对Luciferase标记的K562BCMA Mut细胞的杀伤作用,实时无标记动态细胞分析技术(RTCA)检测BCMA CAR-T细胞对SKOV3BCMA Mut和CHOBCMA Mut细胞的杀伤作用.结果:应用γ分泌酶抑制剂LY411575抑制γ分泌酶活性,显著增强野生型U266细胞表面BCMA表达水平,平均荧光强度上调10倍以上;但撤除抑制剂后BCMA表达水平逐渐降低(P<0.01);BCMA-CD8α TM突变体可抵抗γ分泌酶的切割作用,在U266细胞表面稳定表达(P>0.05);U266细胞及过表达BCMA-CD8α TM的U266细胞与BCMA-CAR-Jurkat-Reporter细胞共培养后都可激活Reporter系统、增强EGFP表达,但该效应在BCMA-CD8α TM过表达的U266细胞中更显著(P<0.01);BCMA-CD8α TM在BCMA表达阴性的K562、SKOV3和CHO 3种靶细胞中成功过表达,且在LY411575处理下该突变体的表达水平仅有小幅度升高;荧光素酶法检测结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可特异、高效杀伤过表达BCMA-CD8α TM的K562细胞;RTCA结果显示,不同效靶比下,BCMA CAR-T细胞均可有效识别、杀伤过表达BCMA-CD8α TM的SKOV3和CHO细胞,但同等效靶比下的Mock-T细胞无此效应.结论:本实验构建的BCMA-CD8α TM突变体能够抵抗γ分泌酶的切割,在多种靶细胞表面稳定表达,为评价BCMA CAR-T细胞体外杀伤的有效性和特异性提供多种检测手段.
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编辑人员丨2024/7/6
