目的 构建人源R-spondin 2(roof plate-specific spondin 2,RSPO2)的真核表达载体,表达、纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切除Fc结构域后,检测RSPO2-Fu的生物学活性.方法 基于生物信息学方法分析人源RSPO2蛋白的理化性质和结构,筛选获得可在溶液中稳定存在的RSPO2截短蛋白RSPO2-Fu.将编码RSPO2-Fu蛋白的基因亚克隆至pCMV-Fc载体后,将质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc瞬时转染入HEK293F细胞中表达72 h,通过Protein A层析柱纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切去Fc结构域,分子筛进一步提纯获得RSPO2-Fu蛋白.最后,通过M50 Super 8 × TOPFlash检测RSPO2-Fu蛋白的生物学活性.结果 生物信息学分析结果显示,RSPO2全长有243个氨基酸,相对分子质量为28 300,等电点为9.42,为亲水性不稳定蛋白,RSPO2-Fu截短蛋白在溶液中的稳定性得到了极大提高;重组表达质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc经菌落PCR及测序证明构建正确;获得了纯度达95％的RSPO2-Fu蛋白;生物学活性检测结果显示,RSPO2-Fu的EC5.值为1.5× 10-12 mol/L.结论 对RSPO2蛋白适当截短后,可获得稳定表达的RSPO2-Fu蛋白,其对Wnt信号通路有明显激活作用,为Wnt信号通路中RSPO2相关生物学研究提供了更好的参考.

目的:体外观察低氧微环境对乳腺癌细胞增殖能力的影响，并探讨其分子机制。方法:细胞增殖检测试剂盒(CCK-8)用于人乳腺导管癌细胞株(BT-474，购于中国科学院上海细胞库)经低氧处理后的增殖能力；应用基因芯片对低/常氧处理后的细胞进行差异基因的表达检测，并在体外行实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)验证；运用癌症基因组图谱(TCGA)及人类蛋白质表达图谱(HPA)数据库分析筛选的差异基因在乳癌及正常乳腺组织中的表达特征，并分析其水平与患者临床病理学特征及预后的相关性；基因组百科全书(KEGG)通路分析、基因过表达实验、蛋白质印迹法(Western blot)等方法探讨其发挥功能的分子机制，组间比较采用 t检验。 结果:BT-474细胞分别经常氧、低氧干预24、36、48 h后，常氧组中的吸光度值显著低于低氧组(0.32±0.03比0.40±0.02， t＝6.351；0.45±0.01比0.52±0.02， t＝4.196；0.57±0.04比0.68±0.03， t＝3.257； P<0.05)；基因芯片分析结果提示R-脊椎蛋白3(r-spondin3，RSPO3)是细胞经低氧处理后显著抑制表达的基因之一；进一步的RT-PCR结果示，低氧组中RSPO3的相对表达量显著低于常氧组(0.56±0.03比0.82±0.04， t＝12.583， P<0.05)；TCGA分析结果示RSPO3在乳腺癌组织中的表达量较乳腺正常组织显著降低(1.41±0.37比3.54±0.19， t＝14.648， P<0.01)，其在乳腺癌组织中表达水平与肿瘤的直径呈负相关( r＝－0.693， P<0.01)；生存分析结果表明，RSPO3低表达组中患者的总生存期(OS)显著低于高表达组[(46.52±0.28)个月比(53.79±0.47)个月， t＝21.357， P<0.01]；此外，KEGG分析结果表明，细胞经低氧处理后β-catenin通路被预测为显著激活；Western blot结果示低氧组细胞核内β-catenin的表达量较常氧组显著升高(0.89±0.06比0.42±0.02， t＝6.241， P<0.05)；与低氧组比较，低氧下过表达RSPO3后24、36、48 h后细胞的吸光度值显著降低(0.43±0.03比0.32±0.02， t＝4.458；0.51±0.01比0.39±0.02， t＝3.267；0.66±0.03比0.49±0.04， t＝4.103； P<0.05)，而在低氧处理同时上调RSPO3表达后核内β-catenin的水平却明显降低(0.93±0.05比0.38±0.07， t＝8.164， P<0.05)。 结论:低氧环境下BT-474细胞可能通过抑制RSPO3的表达，继而活化β-catenin通路促进乳腺癌细胞的增殖能力。

随着人均寿命的延长，肿瘤疾病发病率逐年增高，严重威胁人类生命。分子靶向治疗针对肿瘤疾病所具有的特异性致癌位点予以结合，通过调节遗传物质的表达达到阻断肿瘤生长与转移的目的。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，肿瘤特异性致癌基因或分泌蛋白不断被发现。R脊椎蛋白3(RSPO3)基因属于R脊椎蛋白家族，研究结果显示该基因在机体发育、细胞增殖以及肿瘤领域中发挥着巨大作用。目前，针对RSPO3所涉及的相关肿瘤分子机制研究仍缺乏关键性突破，在今后的研究中应将基础科学实验与临床紧密联合，以期阐明RSPO3在肿瘤疾病中的作用机制。

目的:本研究旨在探讨环黄芪醇对糖尿病性皮肤溃疡模型大鼠创面愈合的影响及其作用机制.方法:受试动物设正常对照组、模型对照组、环黄芪醇20 mg/kg组、环黄芪醇20 mg/kg+IWR-1(Wnt通路抑制剂)8.2 μg/kg组、环黄芪醇20 mg/kg+STF-31(GLUT 1抑制剂)5.8 mg/kg组.除正常对照组外,其余大鼠经腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型,剪去大鼠背部标记区域的皮肤和皮下组织建立皮肤溃疡模型.大鼠按分组灌胃给药14 d,并在给药第5、10、14 d测定大鼠创面愈合率;检测血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)和还原性谷胱甘肽(GSH)的含量;HE染色检测创面组织的病理变化;免疫组化法检测创面组织中血管内皮生长因子A(VEGFA)和内皮型一氧化氮合酶(ENOS)的表达情况;细胞划痕法检测环黄芪醇对脐静脉内皮细胞(HU-VEC)在LPS诱导的炎症状态下迁移率的影响;Western blot法检测给药第10 d的创面组织和LPS诱导后的HUVEC细胞中β-连环蛋白(β-catenin)、糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、特异性顶部盘状底板反应蛋白-3(RSPO3)、G1/S-特异性周期蛋白-D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶-2(MMP2)、基质金属蛋白酶-9(MMP9)蛋白的表达情况.结果:与正常对照组比较,模型对照组大鼠在给药第5、10 d时创面愈合率显著降低(P＜0.01),创面组织中ENOS的表达和血清SOD活力明显降低(P＜0.05或P＜0.01),血清MDA含量明显升高(P＜0.05或P＜0.01);在给药第10 d时,β-catenin、CyclinD1和MMP2蛋白的表达显著下调(P＜0.01);与模型对照组比较,环黄芪醇20 mg/kg组大鼠在给药第10 d时创面愈合率显著升高(P＜0.01),在给药第5、10 d时血清中SOD活力和创面组织中ENOS的蛋白表达显著升高(P＜0.01),β-catenin、cyclinD1和MMP2蛋白的表达明显上调(P＜0.05或P＜0.01).与空白对照组比较,模型对照组细胞的迁移率明显降低(P＜0.05或P＜0.01),CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表达显著下调(P＜0.01);与模型对照组比较,环黄芪醇25 μg/mL组细胞的迁移率明显升高(P＜0.05或P＜0.01),CyclinD1和MMP9蛋白的表达显著上调(P＜0.01)o结论:环黄芪醇能促进糖尿病性皮肤溃疡模型大鼠的创面愈合,其作用机制涉及Wnt/β-catenin信号通路的激活.

目的 本文旨在研究在损伤肝组织中,特异性顶部盘状底板反应蛋白 3(R-spondin3,Rspo3)上调周细胞N-钙黏蛋白(N-cadherin,Ncad,基因名 Cdh2)表达,从而参与小鼠肝损伤.方法 采用反转录实时定量聚合酶链反应法(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)测定 Rspo3,小鼠肝组织富含亮氨酸重复序列 G 蛋白偶联受体 5(leucine-rich repeat-containing G protein-coupled receptor 5,Lgr5)和Cdh2 mRNA表达情况;采用蛋白质免疫印迹方法 以及免疫荧光染色方法 测定Ncad定位以及表达情况;分离并培养小鼠原代骨髓间充质细胞(bone marrow mesenchymal stromal cell,BMSC),采用靶向Lgr5 的RNA干扰实验以确定Rspo3 是否通过作用于Lgr5 上调Ncad表达.结果 在损伤小鼠肝组织中,Rspo3 及其受体Lgr5 显著上调;肝损伤时黏附连接蛋白Ncad表达上调,且与Rspo3 及Lgr5 表达量呈正相关;Ncad主要定位于损伤肝脏的周细胞;使用Rspo3 处理小鼠原代BMSC能够上调Ncad表达,Lgr5 siRNA能使Ncad水平下降.结论 在小鼠损伤肝组织中,Rspo3通过作用于受体Lgr5,上调周细胞中Ncad表达,从而影响小鼠肝损伤.

目的 探讨R-spondin3(RSPO3)在乳腺癌中的表达及预后价值.方法 应用TIMER、癌症基因组图谱(The Canc-er Genome Atlas,TCGA)、基因表达谱数据动态分析(gene expression profilling in-teractive analysis 2,GEPIA2)、人类蛋白质表达图谱(Human Protein Atlas,HPA)等数据库分析RSPO3在乳腺癌组织和癌周正常组织中的差异表达,并分析其表达水平与乳腺癌病理学参数之间的相关性;GEPIA2数据库探讨RSPO3转录本在乳腺癌中的表达及其结构特征;Kaplan-Meier Plotter绘制RS-PO3与乳腺癌患者的预后生存曲线;运用基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)等对其进行基因功能富集分析和代谢通路分析;应用TIMER数据库分析RSPO3的表达水平与肿瘤微环境中免疫细胞浸润的相关性.结果 RSPO3在乳腺癌中呈低表达,且其表达水平与乳腺癌患者的年龄、肿瘤最大径、分子分型相关,在乳腺癌中低表达的RSPO3与患者的预后不良相关;GO功能富集分析显示,RSPO3相互作用的基因主要富集于免疫细胞及其受体等参与的生物学过程;免疫细胞浸润分析结果显示,RSPO3在乳腺癌组织中的表达水平与CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD4+记忆T细胞、巨噬细胞、B细胞等的浸润水平呈正相关,而与调节性T细胞(Treg细胞)的浸润水平呈负相关;KEGG代谢通路分析显示,RSPO3可能参与Wnt/β-catenin通路.结论 在乳腺癌中低表达的RSPO3与患者的不良预后相关,其可能通过抑制免疫细胞浸润及活化Wnt/β-catenin通路参与乳腺癌的进展.

背景与目的:结直肠癌的发生、发展涉及多个癌基因的激活和抑癌基因的失活,野生型R-脊椎蛋白3(R-spondin 3,RSPO3)在结直肠癌生长中的作用目前尚不清楚,本研究旨在探讨RSPO3对结直肠癌生长的影响并探索其潜在机制.方法:采用生物信息学分析RSPO3在结直肠癌及泛癌组织中的表达,分析结直肠癌中RSPO3表达与自然杀伤(natural killer,NK)细胞浸润、NK细胞激活分子表达的相关性.利用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)和慢病毒感染建立RSPO3敲减的SW480-RSPO3-KD细胞株、RSPO3过表达的HCT116-RSPO3-OE细胞株及相应的对照细胞株.采用细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测体外各稳定转染细胞株的细胞增殖.采用流式细胞术分析各稳定转染细胞株的细胞周期、裸小鼠脾脏和移植瘤组织中NK细胞的比例.通过裸小鼠皮下移植瘤模型观察RSPO3敲减或过表达的结肠癌细胞在裸小鼠体内的生长.利用双荧光素酶报告基因系统检测RSPO3敲减或过表达对结肠癌Wnt基因转录活性的影响.结果:生物信息学分析显示,RSPO3在多种实体瘤肿瘤组织包括结直肠癌组织中的表达显著低于相应的癌旁组织.RSPO3敲减或过表达不影响体外SW480和HCT116结肠癌细胞的增殖(P＞0.05)和细胞周期(P＞0.05).但在裸小鼠体内,与对照细胞相比,RSPO3敲减显著促进SW480细胞移植瘤的生长(260.2±162.4 vs 1311.7±570.1,P＜0.05),而RSPO3过表达则显著抑制HCT116细胞移植瘤的生长(1549.0±241.2 vs 512.1±250.0,P＜0.05).流式细胞术分析发现,在荷移植瘤裸小鼠体内,RSPO3敲减显著减少了脾脏和移植瘤组织中NK细胞的比例(脾脏:6.42±0.94 vs 5.25±0.59,P=0.04;移植瘤:8.27±0.29 vs 6.48±1.48,P=0.04);而RSPO3过表达显著增加了脾脏和移植瘤组织中NK细胞的比例(脾脏:5.29±0.16 vs 7.02±0.49,P=0.01;移植瘤:6.39±0.39 vs 8.14±0.34,P＜0.05).癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据相关性分析显示,RSPO3表达与NK细胞表面标志物CD56(r=0.58,P＜0.05)和CD16(r=0.64,P＜0.05)的表达显著正相关,并与NK细胞激活标志物CD69(r=0.51,P＜0.05)和KLRB1(r=0.37,P＜0.05)的表达显著正相关.双荧光素酶报告基因实验结果显示,RSPO3敲减后Wnt荧光素酶活性下调(1.0±0.0 vs 0.45±0.09,P＜0.05),而RSPO3过表达后Wnt荧光素酶活性上调(1.0±0.0 vs 1.75±0.14,P＜0.05).结论:RSPO3能在体内显著抑制结直肠癌移植瘤的生长,并能增加移植瘤组织中NK细胞浸润,RSPO3是一个潜在的结直肠癌的抑制基因.

目的 探讨特异性顶部盘状底板反应蛋白3(RSPO3)在结直肠腺癌中的表达.方法 取30例结直肠腺瘤组织及瘤旁5cm处正常组织、30例结直肠腺癌组织及癌旁5cm处正常组织.蛋白质印迹法(Western blot)检测RSPO3、β-catenin、Bcl-2相关X蛋白(BAX)的相对表达量.免疫组化法检测RSPO3、BAX、β-catenin蛋白的表达情况.Spearman相关性分析法分析RSPO3的表达与β-catenin、BAX表达的相关性.结果 结直肠腺癌组织中RSPO3、β-catenin的相对表达量均高于结直肠腺癌癌旁正常组织,结直肠腺瘤组织中RSPO3、β-catenin的相对表达量均高于结直肠腺瘤瘤旁正常组织,结直肠腺癌组织中RSPO3、β-catenin的相对表达量均高于结直肠腺瘤组织,差异均有统计学意义(P＜0.05).结直肠腺癌组织中BAX的相对表达量低于结直肠腺癌癌旁正常组织,结直肠腺瘤组织中BAX的相对表达量低于结直肠腺瘤瘤旁正常组织,结直肠腺癌组织中BAX的相对表达量低于结直肠腺瘤组织,差异均有统计学意义(P＜0.05).结直肠腺癌组织、结直肠腺癌癌旁正常组织及结直肠腺瘤组织中RSPO3、β-catenin、BAX蛋白表达情况比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);结直肠腺癌组织中RSPO3、β-catenin蛋白高表达率均高于结直肠腺癌癌旁正常组织及结直肠腺瘤组织,BAX蛋白高表达率低于结直肠腺癌癌旁正常组织及结直肠腺瘤组织,差异均有统计学意义(P＜0.05).Spearman相关分析结果显示,结直肠腺癌组织中RSPO3的表达与β-catenin的表达呈正相关(r=0.936,P＜0.05),RSPO3的表达与BAX的表达无相关性(P＞0.05).结论 RSPO3在结直肠腺癌组织中高表达,可能作为结直肠腺癌临床治疗的潜在靶点.

[目的]探讨miR-424对人结肠癌Lovo细胞增殖及Rspo3基因表达的影响.[方法]运用实时荧光定量PCR检测Lovo细胞和正常结肠上皮组织NCM460细胞中miR-424与Rspo3 mRNA的表达水平.miR-424抑制剂(inhibitor)转染Lovo细胞后,观察细胞增殖能力,及miR-424、Rspo3 mRNA、miR-15/16/103表达水平,Western blot检测Rspo3蛋白表达水平.通过在线软件预测靶向Rspo3基因的miRNA,并用双荧光素酶报告基因实验验证.[结果]MiR-424与Rspo3 mRNA在结肠癌Lovo细胞中过表达(P＜0.05).miR-424 inhibitor组Lovo细胞增殖受到明显抑制(P＜0.05),且Rspo3基因表达量显著下降(P＜0.05),miR-15/16/103均上调,其中miR-103上调最显著(P＜0.05).双荧光素酶报告基因实验验证mi R-103可靶向调控Rspo3基因的表达.[结论] miR-424抑制剂可阻滞Lovo细胞增殖且通过反馈性上调miR-103靶向抑制Rspo3基因的表达.

目的 观察R-脊椎蛋白3(Rspo3)对小鼠神经干细胞(NSCs)增殖的影响及其机制.方法 分离、悬浮培养孕14～15 d的CD1胎鼠大脑侧脑室下区(SVZ)NSCs并通过免疫荧光法鉴定.取第3代处于对数生长期的NSCs分为实验组和对照组,体积各为1 mL.实验组添加储存浓度为50 μg/mL的Rspo3蛋白0.8μL(终浓度40 ng/mL),对照组添加等体积的NSCs培养液.干预后6h通过BrdU细胞渗入实验法检测2组NSCs增殖情况.干预后4h和8h采用Western blotting实验检测β-catenin蛋白的表达. 结果 免疫荧光染色结果显示90％以上细胞呈巢蛋白和SOX2阳性.经过诱导分化后,部分细胞呈神经元核抗原或胶质纤维酸性蛋白阳性,证明实验中提取分离的细胞为NSCs.BrdU细胞渗入实验法显示实验组细胞增殖率为1.56±0.03,明显高于对照组(1.04±0.04),差异有统计学意义(P＜0.05).Western blotting实验显示4h和8h时实验组 β-catenin蛋白相对表达量分别为1.09±0.10、1.20±0.13,对照组分别为0.56±0.05、0.83±0.04,实验组明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 Rspo3蛋白可在体外促进小鼠NSCs增殖,其机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关.