目的 探讨1,25(OH)2D3对Aβ1-42诱导阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)细胞模型中细胞焦亡的抑制作用及其机制.方法 将PC12细胞分为对照组、模型组、Caspase-1-siRNA组、NC-siRNA组、1,25(OH)2D3组、联合干预组.对照组仅用DMEM高糖培养基培养细胞;模型组用20 μmol/L Aβ1-42处理细胞以造模;Caspase-l-siRNA组先用50 nmol/L Caspase-l-siRNA 处理细胞,再加入 20 μmol/L Aβ1-42;NC-siRNA 组先用 50 nmol/L NC-siRNA 处理细胞,再加入 20 μmol/L Aβ1-42;1,25(OH)2D3 组用 100 nmol/L 1,25(OH)2D3干预后加入 20μmol/L Aβ1-42;联合干预组先用 50 nmol/L Caspase-1-siRNA 处理细胞,然后用100 nmol/L 1,25(OH)2D3干预,最后加入20 μmol/L Aβ1-42.细胞免疫荧光检测凋亡相关斑点蛋白(ASC)蛋白的表达;Western blot检测细胞焦亡通路相关蛋白表达,包括:NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、天冬氨酸蛋白水解酶-1 前体(pro-Caspase-1)、天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)、消皮素 D-N 端(GSDMD-N)、IL-1 β、IL-1 β 前体(pro-IL-1β)、IL-18和IL-18前体(pro-IL-18)蛋白;吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色检测细胞膜通透性.结果 与对照组相比,模型组ASC蛋白荧光强度增强(P＜0.01),细胞焦亡通路相关蛋白表达均增加(P＜0.05),细胞膜通透性变大(P＜0.01).与模型组相比,1,25(OH)2D3 组和 Caspase-1-siRNA 组 ASC 蛋白荧光强度减弱(P＜0.01),pro-Caspase-1、Caspase-1、GSDMD-N、pro-IL-1β、IL-1β、pro-IL-18和IL-18蛋白表达均下调(P＜0.01),细胞通透性减小(P＜0.01).与Caspase-1-siRNA组相比,联合干预组GSDMD-N和IL-18蛋白表达降低(P＜0.01),细胞通透性减小(P＜0.01).结论 Aβ1-42能够诱导PC12细胞发生细胞焦亡现象.1,25(OH)2D3可以通过抑制Aβ1-42诱导的PC12细胞发生焦亡来发挥其抗炎的神经保护作用,其机制与Caspase-1的抑制密切相关.

目的:探讨利拉鲁肽(lira)对棕榈酸(PA)所致H9C2大鼠心肌细胞脂毒性损伤的干预效果及其相关机制.方法:在不同浓度的PA(0、50、100、150、200、300 μmol/L)和不同时间(6、12、24h)的条件下分别刺激H9C2大鼠心肌细胞(n=3),建立心肌细胞的脂毒性损伤模型,使用CCK8检测确定使H9C2细胞脂毒性损伤较大、细胞存活数最多的刺激条件.将成功建立模型的H9C2细胞分为对照组(CON)、CON+Lira(1 000 nmol/L)组、CON+PA(150 μmol/L)组和 PA(150 μmol/L)+Lira(1 000 nmol/L)组进行油红O染色(n=3),检测细胞内脂质含量,以明确PA(150 μmol/L)对心肌细胞有无脂毒性.将H9C2细胞根据不同的PA浓度(0、50、100、150、200、300 μmol/L)分为 6 个组(CON、PA1、PA2、PA3、PA4 和 PA5)(n=3),按照不同的 Lira 浓度分为 6 组:CON 组、PA 组(150 μmol/L)、CON+Lira3(1 000 nmol/L)组、PA(150 μmol/L)+Lira1(100 nmol/L)组、PA(150 μmol/L)+Lira2(500 nmol/L)组和PA(150 μmol/L)+Lira3(1 000 nmol/L)组(n=3),用蛋白印迹测定凋亡相关蛋白的表达量及其与PA、Lira浓度的关系.结果:使用CCK8检测并最终确定PA为150 μmol/L、刺激12 h的条件下,H9C2细胞的脂毒性损伤较大、细胞存活数最多.与CON组相比,PA组(150 μmol/L)的细胞活性明显下降、脂滴明显增加(t=34.53,P＜0.05),经lira预处理后脂滴明显减少(t=19.07,P＜0.05);与CON组相比,随着PA浓度的增加,Bax、Caspase-3蛋白表达明显增加(F=12.32、3.307,均P＜0.05),Bcl-2蛋白表达明显减少(F=7.618,P＜0.05);与 PA 刺激组(150 μmol/L)相比,lira 预处理可以使 Bcl-2 蛋白表达明显增加(F=7.104,P＜0.05,),Bax、Cas-pase-3蛋白表达明显减少(F=12.32、7.104,均P＜0.05).结论:浓度为150 μmol/L的PA刺激H9C2心肌细胞12 h后可造成心肌细胞脂毒性损伤模型,lira可以改善甚至逆转PA诱导的H9C2心肌细胞脂毒性损伤,其机制可能与抑制炎症、抑制细胞凋亡有关.

目的 探究安胃汤含药血清对MC(MNNG诱导GES-1恶性转化)细胞NLRP3-Caspase-1-IL-1β信号通路相关因子及细胞焦亡的影响,揭示安胃汤抗慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)作用机制.方法 将MC细胞分为空白组、安胃汤组、安胃汤+Z-YVVD-FMK(阻断剂)组、Z-YVVD-FMK(阻断剂)组4组;CCK8分别检测12 h、24 h、48 h时间点细胞增殖情况,确定最佳检测时间点及含药血清比例;检测各组细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性;AO-EB染色法检测细胞膜的完整性及胞核形态;ELISA检测血清白介素-18(interleukin-18,IL-18)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)水平;Real-time PCR检测核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎性小体(NACHT-LRR-PYD-containing proteins 3 inflammasome,NLRP3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteine-requi-ring aspartate protease-1,Caspase-1)、消皮素 D(gasdermin D,GSDMD)、IL-18、IL-1β 基因的表达;W estern-blot 检测NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白的表达.结果 选用48 h时间点、10％含药血清比例加入后续实验;与其余3组比较,安胃汤组LDH活性增高(P＜0.01);给药组AO-EB染色均可见胞膜肿胀变形以及细胞核形态改变;ELISA结果提示:与空白组比较,安胃汤组IL-18、IL-1β均见升高(P＜0.01),Z-YVVD-FMK组IL-18、IL-1β均见下降(P＜0.01),差异具有统计学意义;Real-time PCR检测提示:与空白组比较,安胃汤组NLRP3 mRNA、Caspase-1 mRNA、GSDMD mR-NA、IL-18 mRNA、IL-1β mRNA 表达水平均见升高(P＜0.01,P＜0.05),Z-YVVD-FMK 组 GSDMD mRNA、IL-18 mRNA、IL-1β mRNA表达水平均见降低(P＜0.01),差异具有统计学意义;Western-blot结果提示:与空白组比较,安胃汤组 NLRP3/Actin、GSDMD/Actin 表达上升(P＜0.01),Z-YVVD-FMK 组 Caspase-1/Actin 表达量减少(P＜0.01).结论 安胃汤抗CAG可能与其通过调控NLRP3-Caspase-1-IL-1β信号转导通路诱导胃黏膜细胞焦亡逆转CAG病理状态有关.

目的:研究袖状胃切除术（SG）对肥胖伴2型糖尿病（T2DM）大鼠的作用及可能机制。方法:选取60只大鼠随机均分为正常对照组（A组，n=15只）、单纯肥胖组（B组, n=15只）、肥胖伴2型糖尿病组（C组, n=15只）及袖状胃切除术组（D组, n=15只），分别进行相应造模及干预8周。采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。大鼠空腹血糖（FBG）、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）、葡萄糖耐量试验（OGTT）曲线下面积（AUC）、脂代谢指标[总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）]、炎症指标[C反应蛋白（CRP）、白细胞介素6（IL-6）]、血清淀粉酶（AMY）水平及胰腺组织中葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和半胱氨酸蛋白水解酶-12（Caspase-12）蛋白表达等实验数据均采用（）表示，多组间比较采用One-Way ANOVA分析，LSD检验行组间两两比较。P<0.05为差异有统计学意义。结果:仅D组术后3只大鼠死亡，其余均建模成功。术前，B、C、D组大鼠体重较A组明显升高（P<0.05），C、D组FBG水平及OGTTAUC值明显高于A、B组（P<0.05）；术后2~8周，B组大鼠体重高于A组（P<0.05），D组体重及FBG水平低于C组（P<0.05）；术后8周时，D组大鼠OGTT AUC值及HOME-IR指数明显低于C组（P<0.05）。D组TG水平及CRP、IL -6、AMY水平明显低于C组（均P<0.05）。相比A组，B、C组大鼠胰岛细胞形态不规则且排列紊乱，细胞边界模糊不清，胰岛间质中有空泡出现，可见炎症浸润就脂质沉积出现，C组病理改变较B组加重；D组大鼠上述病理改变较C组减轻。D组大鼠GRP78、Caspase-12蛋白表达明显低于C组（P<0.05）。结论:SG手术能够降低肥胖伴T2DM模型大鼠的体重及血糖水平，改善糖脂代谢，降低胰岛素抵抗，减轻胰腺损伤，可能与抑制GRP78/Caspase-12通路活化相关。

目的 观察芪参还五胶囊改善吡柔比星致小鼠急性心肌损伤并探寻其作用机制.方法 12周龄雄性C57BU6小鼠30只,随机分为对照组、模型组及芪参低、中、高剂量组.通过吡柔比星造模,取材前称量体重并通过心脏超声检测左心室结构和功能,ELISA检测血清心肌肌钙蛋白(cTnI)和氨基端前脑钠素(NT-proBNP)含量;HE染色评价小鼠心肌组织形态学改变;RT-qPCR检测心肌组织中焦亡相关基因NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、消皮素D(GSDMD)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase1)和坏死性凋亡相关基因白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-33(IL-33)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的mRNA水平;Weston blotting检测焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD、Cleaved-Caspase1和坏死性凋亡相关蛋白磷酸化混合谱系激酶样蛋白(MLKL)、磷酸化受体相互作用蛋白激酶3(RIP3)、HMGB1水平.结果 与对照组相比,模型组小鼠精神状态萎靡,体重下降(P＜0.05),射血分数(LVEF)下降(P＜0.05),血清cTnI和NT-proBNP水平升高(P＜0.05),心肌损伤评分升高(P＜0.05),坏死性凋亡相关基因和蛋白水平均有升高(P＜0.05);与模型组相比,芪参还五胶囊可以改善小鼠精神状态,增加体重(P＜0.05),升高LVEF(P＜0.05),降低血清中cTnI和NT-proBNP水平,改善心肌损伤(P＜0.05),降低坏死性凋亡相关基因及蛋白表达(P＜0.05);5组间焦亡相关基因及蛋白表达无明显差异(P＞0.05).结论 芪参还五胶囊可以改善吡柔比星造成的小鼠急性心肌损伤,其机制可能与抑制心肌细胞坏死性凋亡有关.

目的 在锂-毛果芸香碱(Lithium-Pilocarpine)致痫大鼠模型中,检测炎症小体的激活,观察小胶质细胞的活化和异常新生神经元的形成,探索炎症小体激活小胶质细胞促进异常新生神经元形成在癫痫发生发展中的作用机制.方法 通过腹腔注射氯化锂和毛果芸香碱建立癫痫大鼠模型,将大鼠分为Sham组(生理盐水对照组,n=12)、Pilo组(锂-毛果芸香碱致痫组,n=20)和Pilo+MCC950组[锂-毛果芸香碱致痫后给予核苷酸结合结构域富含亮氨酸重复序列和含热蛋白结构域受体3(NLRP3)抑制剂组,n=20],在急性期观察记录大鼠癫痫的行为学表现,通过病理切片确认脑组织损伤情况和细胞激活情况,借助分子检测确认炎症小体和其他分子的表达情况.采用体外细胞模型挽救实验验证炎症小体的作用.结果 Pilo组大鼠有6只出现V级,5只出现Ⅳ级,2只出现Ⅲ级的癫痫发作情况.相较之下,Pilo+MCC950组大鼠则没有出现Ⅴ级,6只出现Ⅳ级,8只出现Ⅲ级,2只出现Ⅱ级的癫痫发作情况.Pilo组强直痉挛发作的潜伏期短于Pilo+MCC950组,Ⅲ级以上癫痫发作的次数和持续时间大于Pilo+MCC950组.Pilo组NLRP3和pro-caspase-1的含量、4种促炎细胞因子的含量以及脑源性神经营养因子(BNDF)和细胞外调节蛋白激酶(ERK)均高于Pilo+MCC950组.免疫荧光检测显示,Pilo组小胶质细胞大量活化,出现大量异常新生神经元.体外细胞实验后,ELISA结果验证了炎症小体的作用.结论 在锂-毛果芸香碱致痫大鼠模型中,炎症小体NLRP3接受外界炎症刺激而活化聚集,进而大量产生多种促炎细胞因子,使得小胶质细胞活化,分泌BDNF并激活ERK信号通路,调控异常新生神经元的形成和聚集等生物学行为,参与癫痫的发生发展.

目的 制备用于周围神经损伤修复的新型合成水凝胶支架材料并评估机械性能及其体外生物相容性.方法 利用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制备新型合成水凝胶,万能试验机检测其机械性能,X线能谱仪分析材料元素组成,电镜观察其微观形貌.培养PC12细胞(PC12,中国科学细胞库)并分为对照组(常规培养)和实验组(新型合成水凝胶),细胞计数试剂盒(CCK-8)、细胞免疫荧光、划痕实验、细胞凋亡实验明确新型合成水凝胶对PC12细胞增殖、迁移及凋亡的作用.蛋白质印迹法(Western blot)检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、Snail、波形蛋白(Vimentin)、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-8、Caspase-3表达量,明确新型合成水凝胶对细胞的黏附作用影响.两组间比较采用非配对t检验.结果 新型合成水凝胶具有良好的拉伸弹性,由初始长度2 cm最大可拉伸至16 cm;元素分析显示材料主要由碳、氧、硅组成;扫描电镜可见新型合成水凝胶具有致密均一网状结构.细胞增殖实验结果显示,PC12细胞对照组吸光度值为1.390±0.154,新型合成水凝胶组为1.093±0.152,差异无统计学意义(t=2.372,P＞0.05).细胞免疫荧光实验结果显示,PC12细胞对照组成熟度为(68.712±2.877)％,新型合成水凝胶组为(74.555±2.412)％,差异无统计学意义(t=2.289,P＞0.05).划痕实验结果显示PC12细胞对照组划痕愈合面积比为(66.576±3.958)％,新型合成水凝胶组为(64.091±2.635)％,差异无统计学意义(t=1.139,P＞0.05).细胞凋亡实验结果显示PC12细胞的凋亡率对照组为(10.360±1.807)％,新型合成水凝胶组为(11.580±1.311)％,差异无统计学意义(t=0.947,P＞0.05).Western blot 结果显示,E-cadherin、Snail、Vimentin、Caspase-8、Caspase-3相对表达量与新型合成水凝胶组分别为0.698±0.040比0.785±0.036、0.646±0.050 比 0.752±0.053、0.759±0.051 比 0.844±0.051、0.772±0.059 比0.836±0.045、0.822±0.024 比 0.822±0.024,差异无统计学意义(t=2.744、2.539、2.039、1.499、1.525,P＞0.05).结论 新型合成水凝胶具有良好的拉伸性和体外生物相容性,可以作为一种周围神经损伤修复的选择方案.

目的:基于基因芯片数据挖掘和网络药理学研究芪归抵挡汤治疗糖尿病肾病(DKD)分子机制.方法:利用相关数据平台,挖掘芪归抵挡汤治疗DKD的活性成分和作用靶点,并进行GO功能和KEGG通路富集分析.最终,通过体内实验验证芪归抵挡汤调控糖尿病肾病的作用机制.结果:芪归抵挡汤共获得349个潜在靶点,GEO数据库分析获得具有显著性差异基因有841个,将二者取交集共获得45个交集靶点,经复合网络筛选出槲皮素、山柰酚、芦荟大黄素、常春藤皂苷元和β-谷甾醇等重要成分;CASP3、EGF、CXCL8、CCL2及ICAM1等治疗DKD的重要核心靶点.GO功能富集显示,药物反应、炎症反应和对缺氧的反应等在生物过程中富集度较高,质膜、细胞溶质和细胞外空间等在细胞组分中富集度高,蛋白质结合、受体结合和整合素结合等在分子功能中富集度较高;KEGG分析表明该方药效基础主要与AGE-RAGE、甲型流感、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、EB病毒感染和NF-κB等信号通路有关.体内研究发现,与正常对照组比较,模型对照组小鼠FBG含量明显升高,血清Scr、BUN含量明显增加,肾组织中AGE、RAGE、Caspase-3蛋白表达上调(P＜0.01);与模型对照组比较,芪归抵挡汤3.34 g/kg组可有效改善db/db小鼠血糖和肾功能(P＜0.01),显著减轻肾脏病理损伤,下调AGEs-RAGE信号通路相关的AGE、RAGE、Caspase-3蛋白的表达(P＜0.01);与白藜芦醇组比较,芪归抵挡汤3.34 g/kg组小鼠治疗6 w、12 w FBG含量,Scr含量明显降低,肾组织AGE、RAGE、Caspase-3蛋白表达明显下调(P＜0.05或P＜0.01).结论:芪归抵挡汤可有效降低糖尿病肾病小鼠的血糖水平、改善肾脏功能及病理损伤,并可调控AGEs-RAGE信号通路,具有清除糖尿病肾病"代谢记忆"潜能.

目的 观察补肾活血方(BSHXF)含药血清对脂多糖(LPS)诱导的软骨细胞炎症及凋亡的影响,探讨BSHXF治疗骨关节炎的作用机制.方法 制备空白血清及BSHXF含药血清.采用LPS诱导C28/I2人正常软骨细胞,构建软骨细胞炎症模型.将细胞分为空白组、LPS模型组、LPS+BSHXF组,空白组以含10％空白血清的培养基培养,LPS模型组以含10μmol·L-1 LPS和10％空白血清培养基培养,LPS+BSHXF组以含10 μmol·L-1 LPS和10％含药血清培养基培养.各组均干预48 h后,CCK-8法检测细胞活力,LDH法检测细胞毒性,ELISA法检测细胞培养基上清液中IL-6、iNOS和COX2的水平,TUNEL染色法检测细胞凋亡情况,Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-9、Bcl-2、Bax的表达及核转录因子-κB(NF-κB)信号通路关键蛋白p-IκBα、IκBα、p-p65、p65的表达.结果 与空白组相比,LPS模型组软骨细胞活力降低,细胞上清液中LDH水平升高,IL-6、iNOS和COX2的水平升高,细胞凋亡率增加,Cleaved-Caspase-9及Bax蛋白表达升高、Bcl-2蛋白表达降低,p-IκBα/IκBα、p-p65/p65比值升高.与LPS模型组相比,LPS+BSHXF组软骨细胞活力增加,细胞上清液中LDH水平降低,IL-6、iNOS和COX2的水平降低,细胞凋亡率降低,Cleaved-Caspase-9、Bax 蛋白表达降低,Bcl-2 蛋白表达升高,p-IκBα/IκBα、p-p65/p65 比值降低.结论 BSHXF可提升LPS诱导的损伤软骨细胞的活性,减轻LPS对软骨细胞的毒性,减少炎症因子释放、抑制软骨细胞凋亡,其机制可能是通过抑制NF-κB信号通路,进而发挥软骨保护作用.

目的 探讨骨坏死康复丸治疗激素性股骨头坏死(Steroid-induced osteonecrosis of the femoral head,SONFH)的主要药理学基础和作用机制.方法 通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)等数据库对骨坏死康复丸的有效成分和靶点进行筛选.基于人类在线孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man,OMIM)和GeneCards数据库筛选 SONFH 的靶点.采用加权基因共表达网络分析(Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)对SONFH基因模块和枢纽基因进行鉴定.取三者的交集,获得骨坏死康复丸治疗SONFH的潜在靶点,并利用Cytoscape软件构建的"活性成分-靶点"网络筛选关键活性成分;然后,利用STRING数据库构建蛋白相互作用网络,筛选关键靶点.进行基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信号通路富集分析,探索"关键活性成分-关键靶点-关键信号通路"之间的关系.最后,进行了关键活性成分与关键靶点的分子对接,并使用SONFH大鼠模型进行实验验证.结果 得到骨坏死康复丸的 146 个化合物和相应的 346 个靶点,获得了 4 187 个SONFH靶点.此外,基于WGCNA筛选出SONFH的 12 个基因模块和2 556 个枢纽基因,得到槲皮素、木犀草素和山柰酚是骨坏死康复丸治疗SONFH的关键活性成分,涉及PI3K/AKT等多条信号通路.分子对接显示关键活性成分与关键靶点之间存在较好的结合活性.动物实验结果证明骨坏死康复丸可通过上调AKT1、PI3K、RUNX2,下调Caspase-3 和IL-6 的表达改善骨生物学改变(P＜0.01),验证了网络药理学部分预测结果.结论 通过网络药理学和动物实验分析了骨坏死康复丸治疗SONFH的潜在作用机制,可为进一步研究其药理基础和靶点提供参考.