目的:研究电离辐射对小鼠骨髓细胞中环状RNA(circular RNA，circRNA)的N 6-甲基腺嘌呤(N 6-methyladenine，m 6A)修饰谱的影响，为揭示RNA表观遗传修饰与放射性造血系统损伤之间的关系提供科学依据。 方法:将24只C57BL/6 J小鼠按随机数表法分为健康对照组和照射组，每组12只。照射组用4 Gy 137Cs γ射线对小鼠进行全身照射。照后将两组小鼠脱颈处死，收集股骨中的骨髓细胞。提取总RNA，通过m 6A RNA免疫沉淀-高通量测序(MeRIP-Seq)技术和生物信息学分析方法，探究小鼠受照后骨髓细胞中circRNA m 6A修饰谱的变化。运用MeRIP-qPCR实验对变化显著的m 6A修饰位点进行验证。 结果:健康对照组和照射组中各鉴定出325和455个(其中两组共有178个，健康对照组特有147个，照射组特有277个)circRNA的m 6A修饰位点。健康对照组和照射组中各鉴定出1 275和1 017个(其中两组共有767个，健康对照组特有508个，照射组特有250个)发生m 6A修饰circRNA的来源基因。与健康对照组相比，照射组中有414个m 6A位点的富集倍数显著上调，178个m 6A位点的富集倍数显著下调，差异具有统计学意义( P < 10 -10；倍数筛选阈值> 5)。基因本体论(GO)分析显示，电离辐射后小鼠骨髓细胞中m 6A修饰水平显著改变的circRNA来源基因涉及染色质相关调控、纤毛转换纤维和多聚(A)特异性核糖核酸酶活性等多种功能。京都基因与基因组百科数据库(KEGG)分析显示，电离辐射后小鼠骨髓细胞中m 6A修饰水平显著改变的circRNA来源基因涉及血小板激活、Fc γ R-介导的吞噬作用和B细胞受体信号通路等多种通路。 结论:电离辐射可引起小鼠骨髓细胞中circRNA的m 6A修饰谱的迅速改变，差异甲基化的circRNA的来源基因涉及多种造血系统放射生物学相关的功能通路。该研究为从表观遗传水平揭示造血系统辐射损伤的分子机制奠定基础。

目的:探讨类甲基转移酶3（METTL3）通过促进叉头框蛋白O（FOXO）3的N6-甲基腺苷修饰（m6A）及其表达参与糖尿病诱导的内皮细胞凋亡的机制。方法:构建晚期糖基化终末产物（AGE）诱导的人主动脉内皮细胞（HAEC）损伤模型，将HAEC分为6组：细胞对照组、细胞AGE组、细胞对照+阴性对照小干扰RNA（siRNA）组、细胞AGE+阴性对照siRNA组、细胞AGE+ FOXO3 siRNA组、细胞AGE+ METTL3 siRNA组，每组设置3个平行组。采用甲基化RNA免疫沉淀测序（MeRIP-Seq）及生物信息学技术检测并分析其m6A修饰谱，采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RIP）检测 FOXO3 mRNA的m6A修饰水平，采用流式细胞术检测细胞凋亡，采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测 FOXO3 mRNA表达水平，Western blotting法检测FOXO3和METTL3蛋白水平。6只6周龄载脂蛋白E基因敲除雄性小鼠按随机数字表法分为单纯动脉粥样硬化组和糖尿病动脉粥样硬化组，每组均为3只。通过Western blotting检测小鼠FOXO3、METTL3蛋白表达，采用免疫荧光共定位检测小鼠FOXO3、METTL3在内皮细胞中的表达。采用两独立样本 t检验进行组间比较。 结果:与细胞对照组相比，细胞AGE组的总m6A修饰及FOXO3的m6A修饰显著升高（ P<0.001），FOXO3和METTL3的蛋白表达显著升高（ P<0.05）。与单纯动脉粥样硬化组相比，糖尿病动脉粥样硬化组小鼠主动脉斑块区域内皮细胞的FOXO3和METTL3的蛋白表达显著升高（ P<0.05）。与细胞AGE+阴性对照siRNA组相比，细胞AGE+ FOXO3 siRNA组的凋亡显著降低（ P<0.01）。与细胞AGE+阴性对照siRNA组相比，细胞AGE+ METTL3 siRNA组FOXO3的m6A修饰（ P<0.001）及FOXO3蛋白表达均显著下降（ P<0.05），且凋亡显著降低（ P<0.001）。 结论:AGE诱导的HAEC中m6A修饰发生了显著变化，METTL3通过促进 FOXO3 mRNA的m6A修饰并调控其表达，从而参与糖尿病诱导的血管内皮细胞凋亡。

目的:探讨重组人甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)处理的视网膜色素上皮(RPE)细胞中mRNA和N6-甲基腺嘌呤(m6A)改变及其机制。方法:将传代ARPE-19细胞贴壁培养后分为正常对照组和MeCP2组，正常对照组细胞采用正常培养液培养，MeCP2组细胞于含终质量浓度20 ng/ml重组人MeCP2蛋白培养液中，连续培养72 h。提取细胞内总RNA进行转录组测序(RNA-seq)和甲基化免疫共沉淀测序(MeRIP-seq)分析。采用edgeR软件包根据 P<0.05筛选差异表达基因(DEGs)和差异甲基化基因(DMGs)。采用基因本体论(GO)富集分析对差异基因进行生物学功能描述，采用京都基因和基因组百科全书(KEGG)进行通路富集分析。筛选出DEGs与DMGs交集的基因，采用实时荧光定量PCR技术检测各组差异基因mRNA表达水平。 结果:共筛选出DEGs 100个，DMGs 7 441个，富集分析发现DEGs与细胞外基质(ECM)－受体相互作用、细胞分裂、细胞周期和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路等相关，DMGs与微管细胞骨架、血管生成、表皮生长因子受体(ErbB)信号通路、晚期糖基化终末产物(AGEs)－糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路、Notch信号通路和转化生长因子β(TGF-β)信号通路等相关。DEGs中24个基因表达增加，76个基因表达减少；DMGs中5个基因含有高甲基化峰，7 439个基因含有低甲基化峰，注释峰后，正常对照组有7 626个基因发生m6A甲基化，MeCP2组有8 006个基因发生m6A甲基化，2个组间有7 360个交集基因。正常对照组和MeCP2组的m6A甲基化富集于转录本的CDS、内含子和3'-非翻译区(3'UTR)区域，其甲基化比例分别为23.62%/22.27%、48.53%/48.35%和23.66%/25.28%。联合分析发现2个上皮－间充质转化(EMT)相关基因 CSPG5和 RBP1的mRNA和m6A水平均降低。荧光定量PCR结果显示，MeCP2组 GSPG5、 RBP1、 ZNF484 mRNA相对表达量均明显低于正常对照组，差异均有统计学意义( t＝7.885、7.613、7.345，均 P<0.01)。 结论:RPE细胞中MeCP2对EMT的调控机制与m6A甲基化修饰相关。 CSPG5和 RBP1基因可能是m6A甲基化的靶基因，参与MeCP2调控的EMT过程。

目的:探讨N6-甲基腺苷(m6A)修饰在脂多糖(LPS)诱导的小鼠急性肺损伤(ALI)的变化，并探讨其机制。方法:将12只8~10周龄的C57BL/6雄性小鼠按照随机数字表法分为对照组和LPS组。LPS组给予LPS(5 mg/kg)气管内滴注，对照组给予同等剂量生理盐水气管内滴注，12 h后取材，比较两组小鼠肺组织湿干重比。比较两组小鼠肺组织病理变化。应用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测炎性因子和相关基因表达水平。运用m6A甲基化免疫共沉淀测序(meRIP-seq)和RNA测序(RNA-seq)技术检测两组小鼠肺组织的m6A修饰水平和RNA水平，并采用生物信息学对结果综合分析。组间比较采用 t检验。 结果:LPS组小鼠肺湿干重比(7.56±0.34)高于对照组(3.99±0.54)，差异有统计学意义( t＝13.749， P<0.05)，且苏木精-伊红(HE)染色提示炎性细胞浸润和肺间质水肿程度加剧。LPS刺激增加小鼠肺组织炎性因子IL-1β(1.00±0.27比11.76±6.78)、IL-6(1.00±0.16比2.16±0.70)、TNF-α(1.01±0.09比1.93±0.73)的mRNA水平，差异有统计学意义( t＝3.447、3.692、2.843， P<0.05)。meRIP-seq共筛选出772个有表达差异的m6A甲基化位点，其中40.93%的位点显著上调。meRIP-seq和RNA-seq联合分析发现50个差异表达基因，包括B细胞易位基因1(BTG1)、心室区表达PH结构域1(VEPH1)、Toll样受体5(TLR5)和驱动蛋白超家族蛋白26A(KIF26A)等。 结论:m6A修饰在LPS诱导的ALI中发生变化，m6A修饰可能作用于BTG1、VEPH1、TLR5、KIF26A等基因，并在ALI中发挥作用。

目的 研究日本血吸虫雌雄成虫环状RNA(circRNA)的N6-腺苷酸甲基化(m6A)修饰,并对circRNA可能调控的miRNA进行预测.方法 取(100±2)条日本血吸虫尾蚴,经腹部皮肤感染小鼠20 min,28 d后麻醉小鼠,用肝门静脉灌洗法收集虫体,分离雌雄虫,提取雌雄虫总RNA,分别取0.5 μg和1.0 μg点样在尼龙膜上,转移至紫外交联仪中,依次与m6A抗体(1∶1 000)和HRP标记的二抗(1∶5 000)孵育,进行斑点杂交.取雌雄虫总RNA各1μg,应用RNA甲基化共沉淀试剂盒进行免疫沉淀分离,RNA建库试剂盒进行建库,生物分析仪质量检测后在高通量测序仪上采用150 bp双端模式进行测序.应用Cutadapt软件(v1.9.3)除去序列中的接头与低质量序列,获得高质量序列.使用Bowtie2软件将序列与血吸虫基因组(Sja_WBPS14)匹配,以Find_circ软件识别序列中的circRNA,MACS软件识别序列中的甲基化位点.利用Heatmap2软件对差异表达的circRNA进行聚类分析,对差异有统计学意义的m6A修饰的circRNA进行来源基因的基因本体论(GO)富集分析.利用DiffReps软件分析m6A修饰的circRNA在雌雄虫的差异情况.通过RNAhybrid软件预测与circRNA相互作用的miRNA,将miRNA反转录后进行qPCR分析,2-△Ct法计算miRNA相对表达水平.结果 斑点杂交结果显示,日本血吸虫总RNA存在m6A甲基化修饰,且随着RNA量的增多,m6A甲基化信号趋于增强.高通量测序结果显示,日本血吸虫高质量序列占比高于99.9％,RNA富集与文库构建效果良好.来源于重叠区的circRNA占49％,其次是外显子(占29％)和基因间(占12％),来源于内含子(占2％)和反义链(占8％)的circRNA较少.雄虫中高富集的circRNA来源的基因可能与细胞代谢进程、细胞成分组织生物发生和应激等相关,雌虫中高富集的circRNA来源的基因可能参与细胞分子结合等过程.雌虫高丰度的m6A修饰circRNA有57个,雄虫有81个,雄虫富集的m6A修饰的circRNA数量高于雌虫(P＜0.05,差异倍数≥2).雌雄虫中m6A修饰circRNA可潜在与多个miRNA相互作用,如Sja-Bantam、Sja-miR-307在雌虫中呈现高表达,Sja-miR-8-3p、Sja-miR-3504等在雄虫中呈现高表达.结论 本研究获得了日本血吸虫雌雄成虫m6A修饰的circRNA表达谱,初步揭示了 m6A修饰circRNA可能调控的miRNA.

目的 本研究探讨肾脏纤维化过程中RNA m6A水平的变化,为深入探讨和研究RNA m6A在肾脏纤维化中的变化及作用机制提供实验基础和理论依据.方法 采用C57BL/6小鼠单侧输尿管结扎方法建立肾脏纤维化小鼠模型(unilateral ureteral obstruction,UUO).随机分为假手术(Sham)组和UUO组.首先运用质谱法检测两组肾脏RNA m6A含量变化,进一步运用RNA甲基化免疫共沉淀(methylated RNA Immunoprecipitation,MeRIP)测序方法检测两组肾脏RNA m6A具体修饰位点的变化情况.在明确纤维化肾脏存在RNA m6A异常修饰后,我们通过RT-PCR方法,进一步筛选肾脏RNA m6A相关的调控酶.结果 与Sham组相比,UUO组肾脏RNA m6A含量显著升高.MeRIP测序分析发现甲基化水平差异>1.5倍的位点共1352个,其中上调位点906个,下调位点446个,包括细胞连接、炎症反应、转分化、钙离子结合、细胞黏附等相关的基因.RT-PCR筛选结果提示甲基转移酶样蛋白(methyltransferase-like protein,METTL)14可能为关键调控酶.结论 RNA m6A表观遗传调控参与肾脏纤维化发生,METTL14可能是关键调控酶.

目的·探讨N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)甲基化修饰在顺铂诱导的小鼠急性肾损伤进程中的作用.方法·选择4只C57bL/6小鼠,尾静脉注射顺铂(20mg/kg)诱导急性肾损伤(损伤组);另取4只C57bL/6小鼠,尾静脉注射等量生理盐水(对照组).检测2组小鼠血清肌酐及血尿素氮水平变化,观察小鼠肾脏组织切片中病理损伤情况,评估模型是否成功.进一步运用甲基化RNA免疫共沉淀技术(methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP)与RNA测序技术分别检测2组小鼠肾脏组织中m6A甲基化水平与RNA表达变化.运用基因本体论及京都基因和基因组数据库进行结果可视化和综合研究,并将RNA测序技术所得转录组数据与MeRIP技术检测所得表观遗传数据联合分析,寻找参与顺铂诱导急性肾损伤病理变化过程的候选基因.结果·顺铂可诱导小鼠血清肌酐与血尿素氮水平显著升高.光学显微镜观察肾组织发现广泛的肾小管空泡变性,上皮细胞剥脱,肾小管坏死,提示造模成功.MeRIP检测发现损伤组与对照组小鼠肾脏中共有2 227个基因含有2 981个差异化表达的m6A甲基化位点(表达变化倍数≥2且P<0.05),这些基因主要富集于代谢及细胞死亡通路.表达差异化m6A甲基化位点的基因与RNA差异化表达基因的联合分析发现1 002个表达趋势相同的基因,如纤维蛋白原α链、溶质载体12家族成员1和甲肝病毒细胞受体1等.结论·顺铂可诱导肾脏组织中基因mRNA上m6A甲基化位点的甲基化水平变化,促进急性肾损伤进程.

目的 研究t(8;21)急性髓系白血病(AML)中AML1-ETO(AE)融合基因与细胞内N6-甲基腺嘌呤(m6A)修饰的关系.方法 利用RNA-蛋白免疫共沉淀和高通量测序技术(MeRIP-Seq)在AE(+)和敲除AE的AML细胞系中进行RNA m6A测序,分析整个转录组m6A修饰的变化.利用高通量测序技术进行转录组测序(RNA-seq).进一步通过GO分析、KEGG通路富集分析对差异修饰的mRNA进行功能注释.实时荧光定量PCR检测m6A相关酶表达量变化.结果 RNA m6A甲基化测序在敲除AE和表达AE的AML细胞系中共检测到26441个基因,包含了72036个m6A peak.AE敲除后细胞内m6A peak的数目由37042个变成34994个,其中有1278个m6A peak升高,1225个下降.AE敲除后新出现了1316个m6A修饰的基因,1830个基因失去了m6A修饰.差异的peak主要在癌症、人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ等通路中富集.RNA-seq结果显示,AE敲除后有2483个基因表达上调,3913个基因表达下调.MeRIP-Seq和RNA-Seq联合分析结果显示,与非m6A修饰的基因相比,m6A所修饰的基因表达水平均相对较高(SKNO-1:0.6116±1.263 vs 2.010±1.655,P<0.0001;SKNO-1 siAE:0.5528±1.257 vs 2.067±1.686,P<0.0001).m6A修饰位于3'UTR或5'UTR的基因较位于外显子区的基因表达量更高(SKNO-1:2.177±1.633 vs 1.333±1.470 vs 2.449±1.651,P<0.0001;SKNO-1 siAE:2.304±1.671 vs 1.336±1.522 vs 2.394±1.649,P<0.05).RNA-seq结果显示,有3种m6A相关酶METTL14、WTAP、ALKBH5的mRNA表达升高(WTAP:5.36±0.5657 vs 13.19±0.3253,METTL14:2.850±0.1556 vs 8.815±1.761,ALKBH5:13.70±0.4596 vs 39.84±6.067,P<0.05).实时荧光定量PCR检测METTL14、WTAP、ALKBH5的表达量变化发现敲除AE后WTAP、ALKBH5的表达量升高,而METTL14的表达量降低(P<0.05).结论 AE敲除造成m6A相关酶差异,推测AE融合基因或许可以调控一种或多种m6A相关酶的表达控制细胞内的甲基化水平,影响m6A修饰模式.

本研究通过甲基化RNA免疫沉淀测序(methylated RNA immunoprecipitation sequencing,MeRIP-seq)、转录物组测序(transcriptome sequencing,RNA-seq)及生物信息学技术,分析小鼠大脑中动脉栓塞/再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型中环状 RNA(cir-cular RNA,circRNA)差异表达谱和m6A修饰差异表达谱,为揭示circRNA表观遗传修饰与脑缺血再灌注损伤之间关系提供科学依据.采用Longa生物学评分评价小鼠神经功能缺损,TTC染色法计算小鼠脑梗死体积,Dot印迹检测m6A整体甲基化水平.结果显示,MCAO/R组与sham组相比出现严重神经损伤,Longa生物学评分为(2.75±0.25)分,MCAO/R组的梗死体积显著高于sham组,所占百分比为(27.63％±4.24％),MCAO/R组m6A整体修饰水平增加.与sham组相比,MCAO/R 组有 1 787 个差异表达的 circRNAs(I log2FC I＞0.58,P＜0.05).其中,852 个 circRNA表达显著上调,935个circRNAs表达显著下调.基因本体(gene ontgology,GO)功能分析显示,差异表达circRNAs靶基因主要参与翻译、蛋白质糖基化、激素应答、IL-6介导的信号通路、高尔基体、内质网等生物学过程;京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路分析发现,差异靶基因主要与N-聚糖生物合成、Wnt信号通路、胃酸分泌、谷氨酸能突触、磷脂酶D信号通路、味觉传导、非洲锥虫病、甲状腺激素合成、胰岛素分泌等代谢途径和信号通路有关.与 sham 组比,MCAO/R 组有22 个circRNAs发生 m6A 甲基化修饰差异(I log2FC I＞0.58,P＜0.05).其中,14 个 circRNA 显著上调,8 个 circRNA 显著下调.GO 和KEGG分析显示,差异甲基化circRNA主要与胞嘧啶代谢过程、骨骼肌收缩、髓样细胞分化、O-连接蛋白质糖基化等生物学过程有关,主要富集到范科尼贫血途径通路.最后,联合表达差异和m6 A修饰差异进行分析,共筛选到7个共表达差异(既有m6A修饰差异,又有表达差异)的circRNA,经RT-qPCR验证,这些共表达差异circRNA表达趋势与测序一致.本研究通过对sham组和MCAO/R组测序分析,筛选有差异表达的circRNA和有m6A修饰差异的circRNA,表明脑缺血再灌注可引起小鼠circRNA表达谱及m6A修饰谱改变,差异表达的circRNA和差异甲基化circRNA靶基因涉及多种通路,为从表观遗传水平揭示脑缺血再灌注损伤的分子机制奠定基础,为后续研究脑缺血再灌注损伤提供了潜在的靶向位点.