目的:探讨连翘苷对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡的影响及其对环状RNA_0054537(circ_0054537)/微小RNA(miRNA，miR)-409-3p的调控作用。方法:体外培养肝癌细胞Hep3B，使用不同剂量(5、10、20 μmol/L)的连翘苷处理Hep3B细胞；采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡率；Transwell小室实验检测细胞迁移及侵袭能力；采用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)法检测circ_0054537、miR-409-3p的表达量；双荧光素酶报告实验检测circ_0054537、miR-409-3p的靶向关系；Hep3B细胞中分别转染si-circ_0054537、pcDNA-circ_0054537，采用上述方法检测细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭。组间比较采用独立样本 t检验，多组间比较采用单因素方差分析。 结果:连翘苷可明显降低细胞活力[(1.276±0.110)个比(1.031±0.090)、(0.637±0.050)、(0.507±0.040)个， F＝244.841， P<0.05]，增高凋亡率[(7.34±0.62)%比(12.44±1.03)%、(22.86±2.12)%、(28.16±2.71)%， F＝244.841， P<0.05]，减少迁移细胞数[(154.15±12.76)个比(124.06±10.04)、(78.05±7.25)、(61.13±5.83)个]及侵袭细胞数[(112.04±10.08)个比(89.43±8.13)、(57.11±5.12)、(43.08±4.05)个， F＝186.018、166.514， P<0.05]，抑制circ_0054537的表达[(1.00±0.10)比(0.40±0.04)， t＝16.713， P<0.05]，促进miR-409-3p的表达[(1.02±0.11)比(3.42±0.31)， t＝21.889， P<0.05]；转染si-circ_0054537可明显抑制细胞活力[(1.264±0.10)比(0.686±0.06)]、迁移[(151.96±11.17)比(79.03±7.21)]及侵袭能力[(115.28±11.05)比(68.14±6.43)， t＝14.869、16.457、11.062， P<0.05]，增高凋亡率[(7.26±0.71)%比(23.79±2.06)%， t＝22.759， P<0.05]；双荧光素酶报告实验证实circ_0054537可靶向结合miR-409-3p；转染pcDNA-circ_0054537可明显逆转连翘苷对Hep3B细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的调控作用。 结论:连翘苷可通过下调circ_0054537的表达而上调miR-409-3p的表达从而抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭及促进细胞凋亡。

目的 探讨微小RNA(miRNA)在右归丸对激素型肾阳虚证肾组织与正常肾组织中的表达差异,并用生物信息学方法分析其意义,为右归丸干预肾阳虚证的进一步机制研究奠定基础.方法 15只SD大鼠随机分为正常组(5只)和造模组(10只),正常组注射2 mL生理盐水,造模组后肢肌注氢化可的松注射液.成模后将造模组随机分为模型组和右归丸组,每组5只.右归丸组给予右归丸汤剂灌胃,模型组和正常组给予生理盐水灌胃.麻醉处死后使用TRIzol法提取肾组织中RNA,使用NanoDrop ND-1000对总RNA进行质量检测,用标记后的RNA与Agilent Rat 8 ×60k miRNA芯片进行杂交.收集原始数据进行标准化处理,进行聚类分析和火山图分析.利用生物信息学方法,预测差异miRNA富集的基因本体论(GO)功能和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路.结果 筛选出右归丸干预肾阳虚证相关差异表达miRNA 18 条(|log2FC|≥ 1.5,P≤0.05),其中包括 5 条上调 miRNA,分别是 rno-miR-149-3p、rno-miR-188-5p、rno-miR-221-5p、rno-miR-762、rno-miR-877;13 条下调 miRNA,分别是 rno-miR-101b-5p、rno-miR-125a-3p、rno-miR-125b-2-3p、rno-miR-3085、rno-miR-344a-5p、rno-miR-347、rno-miR-34b-3p、rno-miR-351-3p、rno-miR-3573-3、rno-miR-370-3p、rno-miR-409a-3p、rno-miR-448-3p、rno-miR-503-3p.GO分析显示差异表达miRNA主要参与DNA、RNA转录的正调控进程且与ATP的结合显著相关.KEGG分析显示差异表达miRNA显著富集于cAMP通路和FoxO信号通路,这两条通路与线粒体功能密切相关.结论 右归丸通过干预miRNA的表达,改善肾阳虚证大鼠线粒体功能,调节能量代谢异常,进一步为右归丸干预肾阳虚证的机制研究提供理论依据.

Objective:Gastrointestinal stromal tumors(GISTs)can rapidly proliferate through angiogenesis.Previous studies indicated the potential influence of microRNA on the progression of tumor immature angiogenesis.This study aimed to explore the specific mechanism by which microRNA-409-5p(miR-409-5p)contributes to GIST.Methods:To identify genes potentially involved in the development and progression of GIST,the differences of miR-409-5p between tumors and adjacent tissues were first analyzed.Following this analysis,target genes were predicted.To further investigate the function of miRNA in GIST cells,two GIST cell lines(GIST-T1 and GIST882)were transfected with lentiviruses that stably expressed miR-409-5p and scrambled miRNA(negative control).Later,the cells were subjected to Western blotting and ELSA to determine any differences in angiogenesis-related genes.Results:In GISTs,there was a decrease in the expression levels of miR-409-5p compared to the adjacent tissues.It was observed that the upregulation of miR-409-5p in GIST cell lines effectively inhibited the proteins hypoxia-inducible transcription factor 1β(HIF1β)and vascular endothelial growth factor A(VEGF-A).Further investigations revealed that miR-409-5p acted as an inhibitor of angiogenesis by binding to the 3'-UTR of Lysine-specific demethylase 4D(KDM4D)mRNA.Moreover,the combination of miR-409-5p with imatinib enhanced its inhibitory effect on angiogenesis.Conclusion:This study demonstrated that the miRNA-409-5p/KDM4D/HIF1β/VEGF-A signaling pathway could serve as a novel target for the development of therapeutic strategies for the treatment of imatinib-resistance in GIST patients.

恶性肿瘤是一种高危疾病,发病率在我国逐年上升,死亡率约占全球的四分之一.患者早期以接受手术治疗为主.但多数恶性肿瘤由于早期临床症状不明显,发现时病情已进展,此时主要给予放疗和化疗,分子靶向治疗等.而多药耐药(multi-drug resistance,MDR)的存在使得相关的肿瘤化疗失败率明显增加,还有分子靶向治疗所带来的巨大费用.这使得寻找新的分子靶点,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移等成为治疗和预防这些疾病的主要挑战.miR-409-3p是一种小型非编码多功能RNA分子,它因在胚胎干细胞中表达被首次报道[1].近年来发现miR-409-3p作为肿瘤抑制因子参与调控肿瘤细胞的多个生物过程,如细胞增殖、生长、迁移、侵袭及凋亡等[2-11].miR-409-3p在多种恶性肿瘤中起着重要作用,如胃癌[2-3]、结肠直肠癌[4-5]、乳腺癌[6-7]、膀胱癌[8]、骨肉瘤[9]以及肺腺癌[10]等.主要通过与靶序列特异性结合,实现对目标基因的降解,并通过在翻译水平上抑制靶基因的表达来发挥作用.越来越多的证据表明,在恶性肿瘤中miR-409-3p的下调或上调是控制癌相关基因表达及信号通路调节的重要机制.

目的:探讨微RNA(microRNA,miR)-409-3p及其靶基因MTF2在鼻咽癌细胞对紫杉醇耐药中的作用以及可能的作用机制.方法:采用CCK-8法和集落形成实验检测鼻咽癌亲本细胞CNE-1和5-8F以及耐药细胞CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol对紫杉醇的敏感性,实时荧光定量PCR法检测miR-409-3p在亲本细胞和耐药细胞中的表达水平.采用脂质体法将miR-409-3p-抑制子(inhibitor)分别转染CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol细胞,采用实时荧光定量PCR法验证转染效率,CCK-8法和集落形成实验检测鼻咽癌细胞对紫杉醇耐药与miR-409-3p之间的相关性.利用Targetscan、miRDB、miRTarBase 和miRWalk数据库预测miR-409-3p可能的下游靶基因,并采用荧光素酶报告基因检测miR-409-3p是否直接靶向结合MTF2基因.采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测转染miR-409-3p-inhibitor(以转入NC-inhibitor为对照)后对MTF2 mRNA和蛋白表达水平的影响.采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测MTF2 mRNA和蛋白在鼻咽癌亲本细胞和紫杉醇耐药细胞中的表达水平.采用脂质体转染法将pcDNA3.1-MTF2(以转入pcDNA3.1-NC为对照)转入CNE-1/Taxol和5-8F/Taxol细胞,CCK-8法和集落形成实验检测过表达MTF2后耐药细胞对紫杉醇药物敏感性的变化,FCM检测MTF2过表达后5-8F/Taxol细胞凋亡率的变化.结果:鼻咽癌亲本细胞对紫杉醇的敏感性明显高于耐药细胞(P＜0.05).鼻咽癌耐药细胞中miR-409-3p的表达水平均高于鼻咽癌亲本细胞(P＜0.001).利用Targetscan、miRDB、miRTarBase和miRWalk数据库进行预测以及荧光素酶报告基因检测证实,miR-409-3p靶向调控MTF2基因.下调鼻咽癌耐药细胞中miR-409-3p的表达水平后,细胞对紫杉醇的耐药性下降(P＜0.05),而MTF2的表达水平增加(P＜0.01);鼻咽癌亲本细胞中的MTF2表达水平高于鼻咽癌耐药细胞(P＜0.01);上调鼻咽癌耐药细胞中MTF2的表达水平后,细胞对紫杉醇的耐药性下降(P＜0.05);上调鼻咽癌耐药细胞5-8F/Taxol中MTF2的表达水平后,细胞凋亡率高于对照组(P＜0.05).结论:miR-409-3p靶向负调控MTF2的表达,抑制此信号轴可以促进紫杉醇诱导的鼻咽癌细胞的凋亡.MTF2可能作为逆转鼻咽癌化疗耐药的靶分子.

目的 分析小鼠感染肝毛细线虫后肝脏microRNA(miRNA)的表达谱,筛选差异表达miRNA,为肝毛细线虫感染致肝纤维化机制研究提供资料.方法 6只雄性BABL/c小鼠随机分为肝毛细线虫感染组和对照组,每组3只.感染组小鼠经灌胃感染肝毛细线虫感染期虫卵(20个卵/鼠),对照组灌胃等量生理盐水.感染后35 d分别取感染组和对照组小鼠的肝组织,进行组织切片、苏木精-伊红(HE)染色后,镜下观察肝组织病变情况.提取和纯化小鼠肝组织总RNA进行文库构建和miRNA高通量测序.通过生物信息学分析筛选差异表达的miRNA,预测其靶基因并进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对部分差异表达miRNA进行验证分析.结果 肝组织切片的HE染色结果显示,感染组小鼠肝组织呈虫卵肉芽肿性病变,伴有明显的炎性细胞浸润;对照组肝细胞形态完整,未见炎性细胞浸润、变性坏死和纤维化.通过miRNA测序,筛选出差异表达的miRNA共16条,4条表达上调,且均上调2倍以上,其中mmu-miR-129-5p上调4倍以上;12条表达下调,均下调0.5倍以下,其中mmu-miR-21a-3p下调0.1倍以下.miRNA靶基因GO功能分析显示,富集的基因主要参与了信号转导、蛋白连接、转化酶活性、G蛋白偶联受体通路、细胞凋亡的负向调控、细胞增殖的正向调控、转录调控等;KEGG通路分析显示,富集的信号通路主要有Hippo信号通路、Ras信号通路、mTOR信号通路、磷脂类信号通路、Wnt信号通路.qRT-PCR检测结果显示,感染组2个上调基因mmu-miR-21a-3p和mmu-miR-181a-1-3p的相对表达水平分别为0.70±0.30和0.68±0.27,2个下调基因mmu-miR-409-5p和mmu-miR-129-5p的相对表达水平分别为1.27±0.24和2.61±0.52,与参考基因相比表达水平均与测序结果趋势一致.结论 肝毛细线虫感染导致小鼠肝组织miRNA表达谱发生了改变,mmu-miR-409-5p和mmu-miR-129-5p等基因可能是参与肝纤维化的候选基因.

目的 通过对慢性阻塞性肺疾病肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)相关肺动脉高压(pulmonary hypertension,PH)循环血中差异性表达的microRNA进行筛查,寻找该疾病新的生物标志物.方法 呼吸内科门诊随访的稳定期COPD不合并PH患者20例(NPH组),COPD合并PH组患者(PH组)20例,每组选取5例采用高通量测序方法筛选出上调表达或下调表达的microRNA;根据差异表达的microRNA,选择与肺部疾病相关的血浆microRNA,采用实时荧光定量检测(qRT-PCR)的方法(每组15例),验证上述高通量测序法检测的结果.结果 建立COPD合并PH患者的循环血microRNA显著异常表达谱,对比NPH组,从中筛选出88个表达量上调的microRNA,109个表达量下调microRNA.与NPH组比较,PH组患者循环血中miR-21-3p、miR-423-3p显著上调(P<0.05),miR-409-5p、miR-483-3p、miR-150-5p显著下调(P<0.05).选取其中显著下调的miR-150-5p,通过TargeterScan、miRDB、TarBase数据库对其进行靶基因预测,对3个数据库预测到的靶基因取交集,共有14个基因与miR-150-5p有靶向关系.通过GO分析发现,miR-150-5p靶基因参与多个信号通路的调节.结论 COPD合并PH患者有着独特的microRNA表达谱.其中miR-150-5p可能作为COPD相关PH的一种新的生物标志物,其靶基因参与多个信号通路的调节.

目的:5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的一线治疗药物,CRC细胞对5-FU的耐药是导致化学治疗(以下简称"化疗")失败的主要原因,然而耐药机制仍不明确.本研究旨在探究参与CRC细胞对5-FU耐药的抑癌基因,并寻找对该基因存在调控作用的微RNA(microRNA,miRNA).方法:在高通量基因表达(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库中下载CRC数据集GSE28702和GSE69657,分别分析2个数据集中对FOLFOX化疗方案应答组和无应答组患者的差异表达基因并确定目标基因;采用在线生物信息学数据库TargetScan、miRwalk和miRDB预测靶向目标基因含山梨醇和SH3结构域蛋白1(sorbin and SH3 domain containing 1,SORBS1)的miRNA.采用瞬时转染技术在CRC细胞系HCT116、SW620中分别转染siSORBS1、HA-SORBS1、miR-223-3p mimic、anti-miR-223-3p及其相应的阴性对照(siNC、HA、miR-NC、anti-miR-NC),在HCT116细胞中共转染miR-NC和HA、miR-223-3p mimic和HA、miR-223-3p mimic和HA-SORBS1、anti-miR-NC和siNC、anti-miR-223-3p和siNC、anti-miR-223-3p和siSORBS1.采用实时反转录PCR(real-time reverse transcription PCR,real-time RT-PCR)和/或蛋白质印迹法检测细胞中SORBS1和miR-223-3p的表达水平.转染后用不同浓度的5-FU处理细胞.采用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞活力,双荧光素酶报告分析验证miR-223-3p与SORBS1的靶向关系.结果:GSE69657数据集和GSE28702数据集应答组分别有409和528个高表达基因,共有22个高表达交集基因.在22个高表达交集基因中,与CRC化疗敏感性有关的抑癌基因有3个,选择SORBS1作为目标基因进一步探索.3个在线生物信息学数据库预测的靶向SORBS1的miRNA为miR-223-3p.用5-FU(25μmol/L)处理HCT116、SW620细胞12～36 h后,2种细胞中miR-223-3p的表达水平均显著下调(均P<0.05).转染siSORBS1或miR-223-3p mimic后,HCT116、SW620细胞中SORBS1表达水平均下调,细胞活力均增加(均P<0.05);转染HA-SORBS1或anti-miR-223-3p后,HCT116、SW620细胞中SORBS1表达水平均上调,细胞活力均下降(均P<0.05).双荧光素酶报告分析结果显示:共转染SORBS13'-非翻译区(untranslated region,UTR)野生型质粒和miR-223-3p mimic的细胞荧光素酶活性显著低于共转染SORBS13'-UTR野生型质粒和miR-NC的细胞(P<0.05).与共转染miR-223-3p mimic和HA的细胞比较,共转染miR-223-3p mimic和HA-SORBS1的细胞活力明显降低(P<0.01);与共转染anti-miR-223-3p和siNC组比较,共转染anti-miR-223-3p和siSORBS1组细胞活力明显增加(P<0.05).结论:MiR-223-3p通过靶向SORBS1基因增加CRC细胞对5-FU的耐药性,miR-223-3p有望成为临床治疗CRC的新靶点.

目的 研究微小核糖核酸(microRNA,miRNA)基因在骨肉瘤患者外周血中的差异表达.方法 收集郑州大学第一附属医院2013年3月至2015年4月收治的40例股骨远端和胫骨近端骨肉瘤患者,同期选择40例健康体检者.分别收集两组患者空腹静脉血,肿瘤组织及对照组相应部位组织,利用miRNA基因芯片对其进行分析,观察miRNA在外周血及骨肉瘤组织中的差异表达.结果 筛查出骨肉瘤肿瘤组织中相关异常表达基因270个,上调miRNA基因15个,下调miRNA基因255个.上调及下调倍数大于2.5的miRNA 19个,上调大于2.5倍的miRNA基因8个:miR-21、miR-451、miR-218、miR-18a、miR-148a、miR-198、miR-195、miR-497.下调大于2.5倍11个:miR-29、miR-223、miR-183、miR-31、miR-654、miR-495、miR-493、miR-410、miR-409-5p、miR-409-3p、miR-382.外周血中异常表达基因178个,上调19个,下调159个.上调及下调倍数大于2.5的miRNA 21个,上调大于2.5倍的miRNA基因12个:miR-21、miR-451、miR-199a、miR-18a、miR-18b、miR-148a、miR-195、miR-497、miR-130b、miR-182、miR-374a、miR-301b.下调大于2.5倍的有9个:miR-29、miR-223、miR-410、miR-133b、miR-31、miR-206、miR-144、miR-493、miR-142-3p.两组结果有较高的重合性.其中表达特异性最明显的是miR-21(上调),miR-29(下调).结论 骨肉瘤肿瘤组织与外周血在miRNA表达上存在一定程度相关性和一致性,其中miR-21和miR-29特异性最明显,并预测其作为生物学标志物的可能性.