目的:探讨微RNA（miR）-146a参与原发性痛风性关节炎发生的可能机制。方法:①培养RAW264.7细胞，给予单钠尿酸盐（MSU）晶体刺激建立痛风炎症模型，经200 μm/ml的MSU晶体刺激后，分别在0、3、6、12 h时间点收集细胞及上清液，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR，TaqMan探针法）检测miR-146a，RT-qPCR检测：白细胞介素-1受体相关激酶（IRAK）1、肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAF）6、NF-κB、IL-1β、TNF-α mRNA，ELISA检测培养上清液IL-1β浓度，蛋白质印迹法检测TRAF 6、NF-κB、IL-1β蛋白表达水平。②用Lipofectamine 2000将miR-146a模拟物（mimic）、miR-146a抑制物（inhibitor）及两者相应对照物分别转染至RAW246.7细胞，将其设置为miR-146a mimic组、miR-146a mimic对照组（mimic control）、miR-146a抑制物组、miR-146a抑制物对照组（inhibitor control），分别用200 μg/ml的MSU晶体刺激各组细胞6 h后，分别检测各组miR-146a、IRAK 1、TRAF 6、NF-κB、IL-1β mRNA和TRAF 6、NF-κB、IL-1β蛋白表达水平。采用SPSS 21.0统计软件进行分析，近似正态分布定量资料以 ± s描述，组间比较采用独立样本 t检验和重复测量方差分析。 结果:① MSU晶体刺激RAW264.7细胞后，实验组在3、6、12 h miR-146a的表达水平较对照组降低（ t=-10.234，-17.059，-26.204， P均<0.01），实验组在6、12 h IL-1β蛋白浓度表达水平较对照组升高（ t=7.552，9.007， P<0.01）；分别检测2组IRAK1、TRAF 6、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA的表达水平：刺激组在3、6 h IRAK 1、TRAF 6、NF-κB、IL-1β mRNA的表达水平较对照组升高（ t=9.847，6.147， P<0.01； t=3.49，3.32， P<0.05； t=3.643，8.471， P<0.05； t=8.726，49.68， P<0.01），实验激组在3个时间点的TNF-α mRNA的表达水平均较对照组升高（ t=4.691，11.115，12.816， P<0.01）。分别检测TRAF 6、NF-κB、IL-1β的蛋白表达水平：实验组6、12 h的TRAF6、NF-κB蛋白相对表达较对照组升高（ t=8.052，8.119， P<0.01； t=22.454，5.845， P<0.01），实验组在3个时间点IL-1β蛋白表达较对照组均升高（ t=18.561，4.74，8.432， P<0.01）。②转染后检测miR-146a mRNA表达，mimics组较mimics control组明显升高（ t=31.769， P<0.01）；inhibitor组较inhibitor control组明显降低（ t=-4.22， P<0.05）。③ miR-146a mimic组经200 μg/ml MSU晶体刺激6 h后，mimic组IRAK1、TRAF6、NF-κB、IL-1β mRNA的表达水平较mimic control组均降低（ t=-14.754，-21.201，-19.381，-17.323， P<0.01），TRAF6、NF-κB、IL-1β蛋白表达水平较mimic control组也降低（ t=-3.137，-32.974，-18.789， P<0.05），inhibitor组结果正好相反。 结论:①过表达miR-146a可降低IRAK 1、TRAF 6、NF-κB、IL-1β表达，抑制MSU晶体介导的炎症，而抑制miR-146a表达可使炎症加重，提示miR-146a参与负反馈调节痛风炎症。② miR-146a可能靶向NF-κB信号通路参与了痛风性关节炎的自发性缓解。

目的:构建丁型肝炎病毒(HDV)感染的肝脏类器官系统，并探讨钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)受体抑制剂布乐韦肽对HDV复制的抑制作用。方法:将由诱导多能干细胞(iPSC)分化的肝细胞样细胞(HLC)接种于倒置胶体晶体聚乙二醇支架(ICC)，构建肝脏类器官系统。质粒转染人肝癌细胞(HuH7)后，收获细胞上清中的HDV颗粒，同时提取HepG2.2.15细胞上清液中的乙型肝炎病毒(HBV)颗粒，将HBV和HDV颗粒共同感染肝脏类器官，构建HDV感染的肝脏类器官，同时以未感染HDV的肝脏类器官作为阴性对照组。采用免疫荧光法在激光共聚焦显微镜下观察肝脏类器官单元的结构及丁型肝炎抗原(HDAg)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的表达。蛋白质印迹法检测肝脏类器官中NTCP和HDAg的蛋白质水平。布乐韦肽Pre组为感染HDV前在肝脏类器官中加入布乐韦肽进行预处理，布乐韦肽Post组为感染24 h后加入布乐韦肽，IFN-α组为感染24 h后加入α干扰素，并设未经药物处理的空白对照组，比较4组的HDV复制情况。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测iPSC分化过程中Nanog同源框(NANOG)、性别决定区Y框(SOX)2、SOX17、叉头框蛋白A2(FOXA2)、肝细胞核因子4α(HNF-4α)、白蛋白、甲胎蛋白、NTCP的mRNA相对表达量，以及药物干预后4组HDV mRNA表达量。统计学分析采用两独立样本 t检验。 结果:iPSC分化为HLC的21 d内，NANOG的mRNA表达量逐渐下降，SOX17、FOXA2的表达量先升后降，HNF-4α、白蛋白、甲胎蛋白、NTCP的表达量逐渐升高。iPSC中NTCP的蛋白质水平为0.118±0.003，低于HLC的1.315±0.073，差异有统计学意义( t＝11.92, P<0.001)。HDV感染后肝脏类器官中HDAg的蛋白质水平高于未感染HDV的阴性对照组(1.284±0.128比0.157±0.040)，差异有统计学意义( t＝23.27, P<0.001)。感染第14天激光共聚焦显微镜下观察到三维球体结构，HDAg与HBsAg高表达。用药干预后第3天，分别与空白对照组(1.000±0.077)比较，IFN-α组(0.453±0.028)和布乐韦肽Pre组(0.136±0.012)的HDV mRNA相对表达量均下降，差异均有统计学意义( t＝19.95、33.15，均 P<0.001)。而布乐韦肽Post组(0.968±0.069)与空白对照组的HDV mRNA相对表达量差异无统计学意义( t＝0.94， P>0.05)。 结论:iPSC衍生的HLC与ICC构建的肝脏类器官能模拟人体肝脏功能，并成功感染HDV颗粒。经布乐韦肽早期阻断能有效降低HDV感染肝脏类器官系统中病毒的复制水平。

目的:克隆幽门螺杆菌(Hp)hp0169基因并进行晶体学研究,分析其二级结构和三维结构.方法:由UniProt数据库中检索Hp NCTC26695菌株hp0169基因及其编码蛋白序列,采用生物信息学方法分析Hp重组胶原蛋白酶(HpPrtC)蛋白理化性质,SOPMA和DNAStrar软件预测HpPrtC蛋白二级结构特征,SWISS-MOPEL软件构建HpPrtC蛋白三维结构,IEDB和ABCpred软件预测HpPrtC蛋白B淋巴细胞抗原表位,SYFPEITHI网站预测T淋巴细胞抗原表位,专家库(EP)算法和随机森林(RF)算法预测HpPrtC蛋白可结晶性.原核表达HpPrtC重组蛋白,经Ni2+亲和层析和分子筛技术纯化蛋白,结晶试剂盒筛选HpPrtC的结晶条件.结果:hp0169基因共包含1 269个碱基配对,编码蛋白全长422个氨基酸,理论等电点为7.64,相对分子质量为47 300.HpPrtC蛋白为亲水性、可溶性蛋白.HpPrtC蛋白α螺旋的氨基酸数量占全部氨基酸数量百分率为35.78%,β片层为18.72%,β转角为 6.87%,无规则卷曲为 38.63%.抗原表位分析,HpPrtC蛋白含有B淋巴细胞的 5个优势线性表位和 3个构象表位及多个T淋巴细胞潜在优势抗原表位.同源建模,HpPrtC蛋白呈二聚体,单体由β折叠围成桶状结构,周围被α螺旋和无规则卷曲围绕.HpPrtC蛋白为中等难度结晶,且无信号肽和跨膜螺旋,在 0.2 mol·L-1 氯化镁、0.1 mol·L-1 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、3.4 mol·L-1 己二醇和pH 8.5条件下出现细小成簇的针状晶体.结论:HpPrtC是一种亲水型蛋白,呈二聚体构造,在适宜条件下呈细小成簇针状晶体,其具有T淋巴细胞和B淋巴细胞优势抗原表位,可作为Hp疫苗设计的抗原,用于构建多价融合疫苗或多表位疫苗,本研究结果为Hp的防治提供了实验基础.

目的 通过网络药理学方法探讨当归拈痛汤改善痛风性关节炎(GA)的作用机制,并通过动物体内实验验证分析.方法 通过TCMSP数据库筛选当归拈痛汤的活性成分,并检索对应靶点,在GeneCards、OMIM等数据库检索GA的相关靶点.利用韦恩图得到药物-疾病交集靶点,用Cytoscape 3.6.1软件分别构建"中药-活性成分-靶点"作用网络及PPI蛋白互作网络.用R语言对交集靶点进行GO和KEGG分析.结合网络药理学分析结果,采用注射尿酸钠晶体溶液诱导建立GA大鼠模型,验证当归拈痛汤改善GA可能的分子机制.结果 确定当归拈痛汤治疗GA的活性成分315个,治疗靶点110个,PPI网络筛选得到20个核心靶点.GO分析表明靶点主要涉及DNA结合转录因子结合、磷酸酶结合和RNA聚合酶Ⅱ特异性DNA结合转录因子结合等多种生物过程;KEGG分析提示NF-κB、Toll样受体及TNF信号通路在当归拈痛汤治疗GA过程中起着关键作用.动物实验表明,与空白对照组相比,模型对照组关节肿胀度显著升高,血清中IL-1β、TNF-α、IL-13水平升高;血清UREA、CREA无明显差异;关节滑膜组织HE染色显示模型对照组滑膜细胞增生,局部细胞变性坏死,大量炎性细胞浸润;TLR4、NF-κB-p65蛋白表达明显上调.与模型对照组相比,各给药组关节肿胀度均有降低;血清中IL-1β、TNF-α水平均降低,IL-13差异无统计学意义;关节滑膜组织HE染色显示双氯芬酸钠组与当归拈痛汤组较模型对照组炎性细胞浸润明显减少.TLR4、NF-κB-p65蛋白表达双氯芬酸钠组、当归拈痛汤组较模型对照组明显降低.结论 当归拈痛汤可能通过调节NF-κB、Toll样受体及TNF等信号通路上相关蛋白表达改善GA.

目的 观察去甲肾上腺素(NE)对体外培养的原代新生大鼠心肌细胞凋亡率及相关凋亡蛋白的影响.方法 选用出生1-3 d的SD大鼠建立原代培养新生大鼠心肌细胞模型.将培养72 h的心肌细胞随机分为对照组(未使用任何药物)与不同浓度NE组(分别采用10-8,10-7,10-6,10-5,10-4 mol/L NE),每组3孔(n=3).加药后3 h采用流式细胞术测定心肌细胞凋亡率;采用Western blot检测CryAB及Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax比值的变化.结果 与对照组比较,10-8,10-7,10-6,10-5,10-4 mol/L NE作用下心肌细胞凋亡率均出现显著升高(均P<0.05);CryAB表达下降(均P<0.05),Bcl-2表达下降(除10-8 mol/L组外均P<0.05)、Bax表达升高(除10-7 mol/L组外均P<0.05),Bcl-2/Bax比值下降(均P<0.05).结论 去甲肾上腺素可能通过降低CryAB、Bcl-2表达,升高Bax表达,降低Bcl-2/Bax比值,诱导体外原代培养大鼠心肌细胞的凋亡率增加.

目的 探讨CRYAB基因变异相关致命性婴儿型肥大型肌原纤维肌病的临床特点及预后.方法 回顾分析2例致命性婴儿型肥大型肌原纤维肌病患儿的临床资料,并结合文献复习.结果 2例患儿均为男性,发病年龄分别为3个月和8个月,均表现为躯干肌肉僵硬,限制性呼吸困难.血肌酸激酶升高,血、尿筛查无显著异常.彩色多普勒超声心动图未见异常.MRI示腹壁肌肉、大腿肌肉等骨骼肌增厚.肌电图示肌强直电位.1例患儿行肌活检示肌源性损害.2例患儿基因检测均显示CRYAB基因c.3 G>A的纯合核苷酸变异,受检者父母均为杂合子;DMPK型基因均未见异常.结论 躯干肌肉强直引起限制性呼吸困难时应行基因检查和肌肉活检,需排除CRYAB基因变异相关致命性婴儿型肥大型肌原纤维肌病.

目的:探讨木犀草素通过Toll样受体(Toll-like receptors,TLR)/髓样分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)通路减轻急性痛风性关节大鼠炎症的作用及其机制.方法:将60只雄性Wistar大鼠随机分为5组:正常对照组、尿酸钠(monosodium urate,MSU)组、秋水仙碱组、木犀草素低剂量组(50 mg/kg)、木犀草素高剂量组(150 mg/kg).于大鼠踝关节局部注射尿酸钠晶体混悬液制备急性痛风性关节炎模型,观察各组大鼠不同时间点的关节肿胀指数,并测定各组大鼠血清及滑膜中白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平,采用实时PCR检测滑膜组织中TLR2,TLR4,MyD88 mRNA水平,蛋白质印迹测定滑膜组织中TLR2,TLR4,MyD88,磷酸化核因子κBp65(phosphorylated-nuclear factorκB,p-NF-κB p65)蛋白表达,HE染色观察踝关节及其周围软组织炎症细胞情况,免疫组织化学法测定NF-κB表达.结果:与MSU组相比,木犀草素高、低剂量组及秋水仙碱组的关节肿胀指数均明显降低(P<0.05),IL-1β,IL-6,TNF-α的水平也显著降低(P<0.01),TLR2,TLR4,MyD88 mRNA和蛋白水平及NF-κB的蛋白水平均显著降低(P<0.01).免疫组织化学结果显示:与正常对照组比较,木犀草素和秋水仙碱组大鼠踝关节的炎症细胞明显减少,滑膜增生减少,软骨表面光滑,无明显软骨和骨侵蚀.结论:木犀草素可通过下调TLR/MyD88/NF-κB通路减轻急性痛风性关节炎的炎症反应,有望成为治疗急性痛风性关节炎的有效药物.

肌原纤维肌病( MFMs )是以缓慢进展的近端和远端无力为特点的一组遗传骨骼肌疾病,具有高度的临床和遗传异质性.研究发现8种经典致病基因与MFMs有关,分别编码结蛋白( DES)、肌收缩蛋白( MYOT)、Z带选择性接合PDZ蛋白(ZASP)、α-B晶体蛋白( CRYAB)、细丝蛋白C( FLNC)、Bcl-2相关抗凋亡蛋白3(BAG3)[1].DES位于2q35,含有9个外显子,其突变所致的结蛋白病是MFMs的一种亚型.结蛋白是存在于横纹肌及平滑肌内的高度保守的中间纤维,具有维持细胞结构稳定的作用[2].现报道1 例DES基因突变所致的MFMs患者,并结合文献复习对该病的临床表现、病理特点以及基因突变情况等进行分析.

目的:观察息痛散对高尿酸血症(HUA)并发急性痛风性关节炎(AGA)大鼠的治疗作用及其机制.方法:通过关节腔注射尿酸钠晶体及腹腔注射氧嗪酸钾溶液建立HUA+AGA大鼠模型,将造模成功大鼠随机分为模型组、秋水仙碱组0.3 mg/(kg·d)、息痛散高剂量组72 g/(kg·d)、息痛散低剂量组18 g/(kg·d),并灌胃治疗5 d和10 d,检测各组大鼠的足跖肿胀度,并检测大鼠血清TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量,观察大鼠滑膜组织内Caspase-1、TNF-α和NF-κB(p65)蛋白表达的变化及滑膜组织病理形态学的改变.结果:息痛散可以改善HUA+AGA模型大鼠关节足跖肿胀度;秋水仙碱约从4 h开始起效,息痛散高剂量组12 h开始起效,息痛散低剂量组24 h开始起效.秋水仙碱及息痛散对血清尿酸无明显降低作用.治疗5 d和10 d时秋水仙碱和息痛散高剂量组TGF-β1、IL-1β、IL-10、Histamin含量均有明显变化,治疗5 d时息痛散低剂量组IL-1β、Histamin与模型组比较,差异无统计学意义(P>0.05),到治疗10 d时,息痛散低剂量组IL-1β、IL-10较模型组差异有统计学意义(P<0.05).关节滑膜组织病理形态学显示,秋水仙碱及息痛散高剂量组关节腔积液、滑膜组织轻度充血、水肿较模型组均减少.息痛散高剂量组可以降低滑膜组织内Caspase-1、TNF-α和NF-κB(p65)蛋白表达.结论:息痛散可以改善HUA+AGA大鼠的足跖肿胀度,其机制可能与抑制滑膜组织内Caspase-1、TNF-α和NF-κB(p65)表达有关.

目的 探索αB-晶体蛋白(CRYAB)在胃癌组织中的表达及化疗药物对CRYAB mRNA表达的影响.方法 回顾性收集西南医科大学附属第一医院及四川绵阳四〇四医院2018年4月至2020年3月期间的行根治性手术切除的76例胃癌患者的癌组织及相应的癌旁组织,使用免疫组织化学SP法检测其CRYAB蛋白的表达,并分析CRYAB蛋白表达与胃癌患者临床病理学特征的关系.此外,收集2018年11月至2020年3月期间西南医科大学附属第一医院收治的21例新辅助化疗后行胃癌根治术的患者以及26例未行新辅助化疗患者的胃癌组织标本,采用qPCR法检测胃癌组织中CRYAB mRNA的表达水平.结果 CRYAB蛋白在胃癌组织中高表达51例(67.1％),在癌旁组织中高表达32例(42.1％),胃癌组织中的高表达率较高(x2=9.581,P=0.002).CRYAB蛋白在胃癌组织中的高表达与肿瘤TNM分期、分化程度、浸润深度、Borrmann分型、淋巴结转移和Lauren分类均有关(P＜0.05),而与年龄、性别、肿瘤部位和肿瘤直径均无关(P＞0.05).新辅助化疗后胃癌组织中CRYAB mRNA的表达水平高于未行新辅助化疗患者(t=8.37,P＜0.001).结论 CRYAB蛋白的高水平表达与胃癌的侵袭和发展密切相关,可能参与胃癌的进程并扮演了至关重要的角色.使用化疗药物后,胃癌组织中CRYAB mRNA的表达水平升高,提示化疗药物一定程度上激活肿瘤细胞的自我保护机制,从而上调CRYAB蛋白的表达,进而影响化疗效果.