[目的]探讨东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis Wnt基因家族中WntA编码蛋白序列特征及其在胚胎发育阶段的时空表达谱,为进一步开展LmmWntA的功能研究及挖掘东亚飞蝗其他Wnt基因家族成员奠定基础.[方法]PCR克隆并利用邻接法(neighbor-joining,NJ)鉴定东亚飞蝗Wnt基因家族基因LmmWntA;通过同源序列多重比对分析LmmWntA氨基酸序列特征;利用整胚原位杂交技术对LmmWntA在东亚飞蝗产卵后(after egg laying,AEL)发育至12,24,35,46,56和65 h以及3,3.5,4,4.5,5,5.5,6.5,8,8.5,9.5和11 d共17个连续胚胎发育阶段进行转录信号筛查.[结果]克隆获得东亚飞蝗LmmWntA(GenBank登录号:MW052768),CDS全长1 101 bp,编码336个氨基酸;LmmWtnA与头索动物、昆虫、有爪动物及环节动物WntA蛋白共同聚为WntA亚家族单系群;LmmWntA中段和C端与比对物种WntA蛋白序列保持了较高同源性,仅在N端信号肽区域出现差异,LmmWntA与膜翅目(Hymenoptera)西方蜜蜂Apis mellifera AmWntA蛋白聚为姊妹群,氨基酸序列一致性为59.05％.LmmWntA最先表达在东亚飞蝗35 h AEL胚胎期末端生长区并在该区域持续表达至4 d AEL胚胎期,同时在新生体节每节腹部形成条纹状表达;在46 h AEL胚胎期视叶后半区持续表达至8.5 d AEL胚胎期,该区域未来发育成复眼;在56 h AEL胚胎期脑持续表达至5.5 dAEL胚胎期;在65 hAEL胚胎期每节腹部的条纹状表达信号逐渐转移至腹中线两侧,在触角基部有明显的表达信号;在5.5 d AEL胚胎期表达信号进一步转移至腹神经;从3 d AEL胚胎期开始在腹侧体节远轴端表达,后期转移至上颚、足关节及末端;伴随4.5 d AEL胚胎末端开始内陷形成肛道,LmmWntA在内陷肛道的腹面及前端表达,最多内陷至腹部第7体节;至9.5 d AEL胚胎期时LmmWntA在翅芽盘处表达.[结论]LnmWntA在东亚飞蝗胚胎发育阶段动态表达,推测LmmWntA参与东亚飞蝗胚胎后端体节生长、神经系统(脑和腹神经)、复眼、触角、消化系统后端(肛道)、颚、胸部附肢(足和翅)等重要组织和器官的发生和形成.本研究结果为进一步开展LmmWntA功能缺失研究奠定发育生物学基础.

获得完整的神经系统是蝗虫解剖实验的难点,使用福尔马林液浸标本解剖时神经易断裂,使用活体或经过冷冻、冷藏处理的东亚飞蝗为解剖材料,神经能保持弹性,在分离咽下神经节和围咽神经环时小心去除头壳内幕骨,可获得完整的神经系统.

以美洲大蠊Periplaneta americana为原料生产的康复新液等药品临床疗效显著,得到了广泛应用.本文以四川好医生攀西药业有限责任公司饲养的药用美洲大蠊为材料,首次采用Illumina HiSeq 2000和PacBio SMRT测序平台开展了全基因组测序,并进行基因组组装、注释和分析.原始测序数据经过滤后得到1.4Tb的二代测序数据和33.81 Gb的三代测序数据.组装结果表明,美洲大蠊基因组大小为3.26 Gb,这在已报道的昆虫基因组中仅次于东亚飞蝗Locusta migratoria.基因组重复序列含量为62.38％,杂合度为0.635％,表明其为复杂基因组.组装的Contig N50和scaffold N50长度分别为28.2 kb、315 kb,单拷贝基因完整性为88.1％,小片段文库测序数据平均比对率为99.8％,测序和组装质量满足后续分析要求.采用De novo预测、同源预测和基于转录本预测3种方法共注释到14 568个基因,其中92.4％的基因获得了功能注释.本研究首次完成了美洲大蠊的全基因组测序,也是大蠊属Periplaneta昆虫的第一个基因组,为美洲大蠊遗传进化分析和药用基因资源挖掘打下了重要基础.

为研究短时高温对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis Meyen血淋巴蛋白的影响,采用Bradford法、SDS-PAGE电泳和质谱等方法,对东亚飞蝗雌虫血淋巴样品进行检测.结果表明:短时高温对血淋巴蛋白含量有显著影响(P＜0.01),36℃-42℃范围内,随温度升高,血淋巴蛋白浓度亦升高,其中39℃、42℃处理组与对照组差异显著(P＜0.01);短时高温对血淋巴蛋白种类存在一定影响,对照组雌虫血淋巴中存在11种蛋白,高温处理后,4种蛋白含量逐渐增加,6种蛋白含量没有明显变化,1种蛋白消失;经质谱检测,鉴定了5种蛋白,分别为载脂蛋白前体、酚氧化酶原、2个储存蛋白和19 kDa血淋巴蛋白,另外6条蛋白未被鉴定.推测载脂蛋白前体、酚氧化酶原、储存蛋白在东亚飞蝗应对高温胁迫过程中发挥重要作用.

在动物学实验中使用冷冻或冷藏处理的东亚飞蝗进行解剖,可以展示饱满的心脏、大血管、翼状肌、背膈及中胸和后胸血液循环辅搏器等结构.通过中、后胸部血液循环辅搏器可以确定大血管的位置.该方法在教学上取得了良好的效果.

[目的]化学感受蛋白(chemosensory proteins,CSPs)是一类小分子的可溶性蛋白,在昆虫中发挥多种作用.本研究旨在组装中国北方主要草原害虫之一——亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus的触角转录组,鉴定出化学感受蛋白基因以及分析其在成虫不同组织中的表达水平.[方法]利用RNA-Seq对亚洲小车蝗成虫触角进行转录组测序和组装;通过筛选转录组数据库、克隆及测序,鉴定出化学感受蛋白基因;应用qPCR分析CSP基因在成虫不同组织(触角、去除触角和口器的头、上唇、去掉下唇须的下唇、下唇须、下颚须、胸部、跗节、翅和腹部)中的表达模式.[结果]成功构建了亚洲小车蝗成虫触角转录组,共获得61 629个unigenes,平均长度为733 nt,总长度和N50分别为45 175 449和1 130 nt.其中26 064个unigenes (42.29％)注释到6个数据库(NR,NT,Swiss-Prot,KEGG,COG和GO).通过Blast验证、克隆和测序鉴定出17个CSP基因;BlastP和系统发育分析表明亚洲小车蝗CSPs(OasiCSPs)与东亚飞蝗Locusta migratoria CSPs(LmigCSPs)和沙漠蝗Schistocerca gregaria CSPs(SgreCSPs)关系最密切.qPCR分析表明,8个CSP基因在成虫不同组织中的表达水平存在显着差异,特别是,OasiCSP8在下唇须和下颚须中高表达,而OasiCSP11和OasiCSP13在触角中表达量最高.OasiCSP15在化学感受器官(触角、上唇、去掉下唇须的下唇、下唇须、下颚须和跗节)中的表达量远高于非化学感受器官(去掉触角和口器的头部、胸部、翅和腹部)中的表达量,而OasiCSP12在几乎所有测定的组织中具有相似的表达分布.[结论]OasiCSPs在亚洲小车蝗化学感受和发育过程中可能起着多种作用,这些结果为进一步研究这些化学感受蛋白在亚洲小车蝗中的功能奠定了基础.

对东亚飞蝗的致病性菌褪色沙雷氏菌进行分型研究,为东亚飞蝗的生物学防治研究或可构建基因工程菌的候选菌株.利用血清型分型与脉冲场凝胶电泳分型方法对不同地区及个体的病死蝗虫中分离的10株细菌与模式菌株(ATCC 13880)进行了分析.结果 显示,由不同地区及个体中分离得到的褪色沙雷氏菌同源性存在差异性,基因分型相似性在64％～100％之间,存在不同程度的亲缘关系.本试验丰富了褪色沙雷氏菌的生物学性状内容,也为对褪色沙雷氏菌的检验与进一步深入研究提供了具有参考价值的资料.

为明确东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis对植物群落的利用特征,采用自然生境中罩笼的方法,观察东亚飞蝗对栖息高度的选择行为,分析发生代数、种群密度、调查时间以及环境温湿度对东亚飞蝗栖息高度选择的影响.结果表明:东亚飞蝗夏蝗偏好栖息在0～20 cm,秋蝗偏好栖息在>80 cm.在食物充足的条件下,当蝗蝻密度d≤20头/m2时,东亚飞蝗偏好栖息在植株中上部,以>80 cm的蝗虫数量比最大;种群密度d=100头/m2,飞蝗偏好栖息在植株较低位置,以0～20 cm的蝗虫数量比最大.东亚飞蝗在日出之前和日落之后偏好栖息在植株中上部;在12:00和16:00这两个时间段偏好选择栖息在植株中下部.选择栖息在0～20、40～60和>80 cm这3个高度的东亚飞蝗数量百分比与环境温度呈负相关,但是与环境湿度呈显著的正相关(P<0.05).这说明随着温度的降低或湿度的增加,飞蝗偏好栖息在这3个位置.

[目的]筛选出微孢子Paranosema locustae感染条件下东亚飞蝗Locusta migratoria实时定量PCR最适内参基因.[方法]本研究应用实时荧光定量PCR技术测定东亚飞蝗甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18s 核糖体RNA(18sRNA)、微管蛋白基因(Tubulin,TUB)、肌动蛋白基因(Actin,ACT)和延伸因子1 基因(Elongation factorl,EF1)5个候选基因在3个微孢子浓度(1 × 104、1 × 106和1 × 108个孢子/头)感染12 d后的表达稳定性;应用geNorm、Bestkeeper和Normfinder 3个软件综合分析5个内参基因的稳定性.[结果]geNorm软件对5个内参基因在不同微孢子虫浓度感染下稳定性分析结果表明:18S基因稳定性最低,平均表达稳定性值M值最高为0.658 4,TUB基因稳定性最高,M值最低为0.278 4.NormFinder软件分析在不同微孢子虫浓度感染下的5个内参基因的稳定值分别为0.152(EF1)、0.181(ACT)、0.212(TUB)、0.329(GAPDH)和0.395(18S),可知内参基因稳定性顺序为:EF1 ＞ACT＞ TUB＞GAPDH＞ 18S.由BestKeeper软件分析表明5个候选内参基因的SD值均小于1.0,表达均较稳定.根据其变异系数值Cv的大小可知,ACT基因最为稳定.[结论]综合3种软件分析结果,在不同微孢子虫浓度感染下,可选择的较为稳定的内参基因ACT、EF1和TUB基因作为相对定量的参照基因.

本研究对东亚飞蝗的致病性菌褪色沙雷氏菌进行分型研究,可为东亚飞蝗的生物学防治研究提供思路.利用血清型分型与脉冲场凝胶电泳分型方法对不同地区及个体的病死蝗虫中分离的10株细菌与模式菌株(ATCC 13880)进行了分析.结果 显示,不同地区及个体中分离得到的褪色沙雷氏菌同源性存在差异性,基因分型相似性在64％～100％之间,存在不同程度的亲缘关系.本研究丰富了褪色沙雷氏菌的生物学性状内容,也为对褪色沙雷氏菌的检验与进一步深入研究提供了具有参考价值的资料.