目的:构建丝素蛋白（SF）、细菌纤维素（BCNR）、羟基磷灰石（HAp）复合骨再生支架并评价其促成骨活性的价值。方法:将HAp颗粒、BCNR和骨形态发生蛋白2（BMP2）依次加入SF水溶液中，搅拌均匀后倒入不同大小的模具，-25 ℃下处理24 h，冷冻成型，通过冻干机将复合支架冻干。将SF与BCNR不同质量比的复合支架设置为A组（2∶1）、B组（4∶1）、C组（6∶1），将未加入BMP2的无活性复合支架设置为D组。扫描电镜检测支架的表面形貌和孔隙结构；压汞仪检测支架的孔隙率；万能材料试验机压缩支架，获得应力-应变曲线，分析支架的压缩强度和杨氏模量。将永生化小鼠胚胎成纤维细胞（iMEF）接种到A组、B组、C组及D组复合支架上。细胞接种4、8 d后，细胞活/死染色检测各组活细胞和死细胞比例；细胞计数试剂盒8（CCK-8）实验检测各组细胞的增殖活性；碱性磷酸酶（ALP）染色检测各组染色阳性细胞；ALP活性检测观察各组细胞的ALP活性。选取15只雌性SD大鼠，构建大鼠肌袋异位成骨模型，植入不同SF与BCNR质量比的复合支架及未加入BMP2的无活性复合支架，分别为A′组（2∶1）、B′组（4∶1）、C′组（6∶1）和D′组，另设假手术组，每组3只。假手术组在切开皮肤、钝性分离股四头肌肌肉，于肌肉中形成肌袋后，仅缝合肌袋及皮肤，不植入支架，其他四组在肌袋内植入对应的支架，并缝合肌袋及皮肤。术后2、4周行X线片检查，观察各组骨形成情况。术后4周，收集植入的支架与组织复合物，进行病理组织切片、HE染色和Masson 染色，观察各组成骨情况。另对组织切片进行免疫组化染色，观察各组成骨标志物Ⅰ型胶原蛋白（COL1）和骨桥蛋白（OPN）的表达情况。结果:扫描电镜显示，相较于A组和C组，B组片层结构和微孔结构更加规则、均匀；孔隙率分析结果表明，B组和C组孔隙率分别为（89.752±1.866）%和（84.257±1.013）%，均高于A组的（81.171±1.268）%（ P<0.05或0.01），而C组孔隙率低于B组（ P<0.01）。力学性能检测结果显示，B组和C组压缩强度分别为（0.373±0.009）MPa和（0.403±0.017）MPa，均高于A组的（0.044±0.003）MPa（ P<0.01），B组和C组杨氏模量分别为（7.413±0.094）MPa和（9.515±0.615）MPa，均高于A组的（1.881±0.036）MPa（ P<0.01），而C组压缩强度和杨氏模量均高于B组（ P<0.05或0.01）。细胞活/死染色结果显示，细胞接种4 d后，B组死细胞明显少于A组、C组和D组；细胞接种8 d后，B组活细胞最多，死细胞最少。CCK-8实验结果显示，细胞接种4 d后，A组和B组细胞增殖活性分别为0.474±0.009和0.545±0.018，均高于D组的0.394±0.016（ P<0.01），C组细胞增殖活性为0.419±0.005，与D组差异无统计学意义（ P>0.05），而A组和C组细胞增殖活性均低于B组（ P<0.01）；细胞接种8 d后，B组细胞增殖活性为1.290±0.021，高于D组的1.047±0.011（ P<0.01），C组细胞增殖活性为0.794±0.032，低于D组（ P<0.01），A组细胞增殖活性为1.086±0.020，与D组差异无统计学意义（ P>0.05），而A组和C组细胞增殖活性均低于B组（ P<0.01）。ALP染色结果显示，细胞接种4、8 d后，相较于D组，A组、B组和C组有更多的阳性细胞，B组阳性细胞多于A组和C组。ALP活性检测结果显示，细胞接种4 d后，A组、B组和C组细胞ALP活性分别为1.399±0.071、1.934±0.011、1.565±0.034，均高于D组的0.082±0.003（ P<0.01），而A组和C组细胞ALP活性均低于B组（ P<0.01）；细胞接种8 d后，A组、B组和C组细胞ALP活性分别为2.602±0.055、3.216±0.092、2.145±0.170，均高于D组的0.101±0.001（ P<0.01），而A组和C组细胞ALP活性均低于B组（ P<0.01）。X线片检查结果显示，术后2周，假手术组、D′组、A′组和C′组均无明显骨形成，而B′组有明显骨形成；术后4周，A′组、B′组和C′组均有明显骨形成，B′组骨形成明显多于其他两组，而假手术组和D′组均无明显骨形成。HE染色和Masson染色结果显示，术后4周，B′组形成大量均匀分布的新生骨组织，而A′组和C′组只在局部有少量新生骨组织，D′组仅有部分组织长入，且无明显新生骨组织，B′组形成的新生骨组织的成熟度比A′组和C′组更高。免疫组化染色结果显示，B′组COL1和OPN阳性染色均较A′组和C′组更多。COL1和OPN表达强度分析结果显示，A′组、B′组和C′组COL1表达强度分别为2.822±0.384、22.810±2.435、12.480±0.912，OPN表达强度分别为1.545±0.081、5.374±0.121、2.246±0.116，B′组和C′组COL1、OPN表达强度均高于A′组（ P<0.01），而C′组COL1和OPN表达强度均低于B′组（ P<0.01）。 结论:基于SF、BCNR和HAp成功构建复合骨再生支架，其中SF和BCNR质量比为4∶1的复合支架具有均匀孔隙结构、高孔隙率、良好的力学性能和生物相容性、优异的体外促成骨性能，还具有优异的骨诱导性和骨传导性。

本研究建立和鉴定TREX1基因667G>A突变的Aicardi-Goutières综合征（AGS）患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs），获得Aicardi-Goutières综合征的诱导多能干细胞模型（AGS-iPSCs）。2020年12月中山市人民医院收治了1例Aicardi-Goutières综合征的3岁男性患儿，在家属知情同意下，收集患者5 ml外周血标本并分离单个核细胞。利用仙台病毒将OCT3/4、SOX2、c-Myc和Klf4四种转录因子转导外周血单个核细胞（PBMCs），将其重编程为诱导多能干细胞。通过形态学、RT-PCR、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）染色、免疫荧光、体内畸胎瘤分化潜能实验及核型分析对其多能性和分化能力进行鉴定研究。结果显示成功构建Aicardi-Goutières综合征的诱导多能干细胞系，稳定传代后显示出典型的胚胎干细胞样形态，RT-PCR呈现出干细胞标志物的mRNA表达，AP染色阳性，OCT4、SOX2、NANOG、SSEA4、TRA-1-81和TRA-1-60多能性标记蛋白均为强阳性表达，体内畸胎瘤形成实验表明iPSCs可向外胚层（神经管样组织）、中胚层（血管壁组织）和内胚层（腺体样组织）分化，核型分析也证实了iPSCs仍保持原有核型（46，XY）。综上，本研究利用仙台病毒成功建立了Aicardi-Goutières综合征诱导多能干细胞系，为研究该疾病的发病机制和药物筛选提供了重要的模型平台。

胰岛是体内调控血糖稳态的重要结构，由多种内分泌细胞组成，起源于内胚层的前肠结构。胰岛胚胎发育过程中，内分泌祖细胞通过调整诸多基因转录完成内分泌细胞的分化成熟。单细胞测序的出现为探究胰岛发育过程中转录组变化提供了良好的研究平台。降维与特征选择方法的运用使得单细胞测序技术在建立胰岛发育图谱、寻找胰岛干细胞及探索其体外诱导分化调控方面具有显著优势。该文就单细胞测序技术在胰岛胚胎发育研究中的应用进行探讨，以期更好地将单细胞测序技术应用于胰岛发育和糖尿病治疗等的研究中。

目的:探究活性氧（ROS）/硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）信号通路在高糖诱导下人胚胎滋养层细胞焦亡变化情况。方法:体外培养人胚胎滋养层细胞，建立高糖损伤模型，分为对照组、高糖（HG）组、HG+ROS抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（HG+NAC）组。噻唑蓝（MTT）法检测各组细胞存活率变化情况；二氢乙啶-ROS荧光探针法检测各组细胞的ROS水平；实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测转染后各组细胞TXNIP和NLRP3 mRNA表达情况；蛋白免疫印迹分析法检测各组细胞TXNIP、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-1和白细胞介素（IL）-1β及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、GSDMD蛋白表达水平；流式细胞术检测各组细胞焦亡情况。结果:高糖诱导人胚胎滋养层细胞损伤的最佳D-葡萄糖浓度为30 mmol/L；与对照组（96.27±3.10）%相比，HG组（55.44±2.15）%人胚胎滋养层细胞存活率显著降低（ P<0.05），7'二氯荧光素（DCF）荧光强度（ROS水平）、TXNIP、NLRP3蛋白表达水平、细胞焦亡数目、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和TNF-α蛋白表达水平显著升高（ P<0.05）；与HG组相比，HG+NAC组（84.75±2.33）%人胚胎滋养层细胞存活率显著升高（ P<0.05），DCF荧光强度（ROS水平）、TXNIP、NLRP3蛋白表达水平、细胞焦亡数目、Caspase-1、GSDMD、IL-1β和TNF-α蛋白表达水平显著降低（ P<0.05）。 结论:抑制高糖诱导下人胚胎滋养层细胞内ROS水平，可能通过抑制TXNIP/NLRP3信号通路，促进细胞增殖，并减少焦亡的发生。

目的:构建表达视觉系统同源框2( VSX2)增强绿色荧光蛋白(eGFP)报告基因的人诱导多能干细胞系(hiPSCs)。 方法:根据成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)技术原理，设计 VSX2的小向导RNA(sgRNA)，构建敲除质粒及包含左右同源臂的P2A-eGFP供体质粒；2个质粒经测序鉴定后电转野生BC1-hiPSCs细胞系，采用嘌呤霉素筛选获得单克隆，扩增培养并鉴定。采用PCR和Sanger测序鉴定基因型；采用核型分析法分析报告细胞系核型；采用STR法排除细胞交叉污染；采用免疫荧光法及逆转录PCR法检测报告细胞系的多能干细胞分子标志物的表达；通过体外三胚层形成实验鉴定报告细胞系向三胚层分化的能力；应用3D视网膜类器官诱导技术获得视网膜类器官，并采用免疫荧光染色法评价VSX2蛋白与eGFP的共定位情况。 结果:电转后通过PCR鉴定和Sanger测序成功筛选到1株含有 VSX2-eGFP报告基因的hiPSC系。核型分析结果显示该报告细胞系核型正常。STR鉴定结果表明，BC1- VSX2 eGFP-iPSCs无细胞系交叉污染。逆转录PCR检测和免疫荧光染色表明，BC1- VSX2 eGFP-iPSCs中iPSCs标志物基因和蛋白表达阳性，包括NANOG、OCT4、SOX2、DNMT3B和GDF3 mRNA以及NANOG、OCT4、SSEA4和TRA-1-60蛋白。免疫荧光染色表明，由BC1- VSX2 eGFP-iPSCs分化的三胚层组织中内胚层标志物甲胎蛋白(AFP)、中胚层标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和外胚层标志物神经细胞特异性微管蛋白(TUJ1)表达均为阳性；eGFP与VSX2共表达于视网膜类器官的神经视网膜。 结论:成功构建1株表达 VSX2-eGFP报告基因的hiPSCs，该细胞系可实时指示VSX2蛋白的时空表达变化，为视网膜发育、疾病机制研究及治疗方法评价提供有力工具。

类器官是一种在体外由干细胞诱导分化形成的、与体内器官具有高度相似组织结构的简化版器官，其中视网膜类器官研究深入且广泛。视网膜类器官的诱导分化技术经历了多次改进，效率不断提高，发育程度不断完善。视网膜类器官在作为视网膜发育和疾病模型、替代治疗的种子细胞库等方面有着广阔的应用前景。然而，视网膜类器官仍有很大的研究空间，其诱导分化的普适性、高效性、类器官诱导分化的异质性及其与胚胎视网膜发育的差异性等仍是该领域亟待解决的问题。研究人员应深入、细致地了解类器官发育过程中的分子、基因、细胞乃至组织结构等多个层面的调控机制，以促进视网膜类器官技术的临床应用。

角膜类器官是利用诱导多能干细胞或胚胎干细胞体外培养得到的类角膜组织结构，与人体角膜具有相似的解剖学特征和基因表达谱。虽然角膜类器官存在培养难度大、成本高、耗时长等问题，但由于其能更真实再现角膜的生理环境以及各层细胞间的相互作用关系，具有广阔的应用前景。本文汇总国内外最新研究进展，总结角膜类器官在角膜发育及角膜病发生机制、角膜移植供体和角膜类器官芯片等研究方向中的应用，以期为临床进一步开展持续研究提供参考，使角膜类器官可更广泛应用于疾病模型、药物筛选、个性化医疗等更多角膜病医疗领域。

目的:探讨压力对与兔视网膜神经节细胞(RGCs)共培养的视网膜干细胞(RSCs)分化的影响。方法:选取SPF级新西兰孕22 d兔，取出胚胎，获取视网膜睫状缘色素上皮组织，培养原代RSCs。选取SPF级新生新西兰大白兔6只，分离视网膜神经上皮层组织，培养原代RGCs。采用巢蛋白(Nestin)抗体免疫荧光染色法、溴脱氧核苷尿嘧啶(BrdU)流式细胞术分析、RSCs自发分化细胞免疫荧光检测及流式细胞术分析鉴定体外培养的兔RSCs，采用免疫荧光染色法以Brn3b抗体及Thy1.1抗体鉴定RGCs；将RGCs和RSCs分别放在Transwell的上下层培养，构建共培养体系。分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法检测0、20、40、60、80 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)压力条件下室RSCs及分化所得细胞的Nestin和Thy1.1 mRNA和蛋白表达变化。结果:体外培养的兔RSCs特异性标志物Nestin抗体染色阳性；BrdU流式细胞术分析结果显示，BrdU阳性细胞占分离RSCs细胞的(92.26±3.28)%；免疫荧光检测结果显示，RSCs分化细胞中，部分细胞Brn3b抗体表达阳性，部分细胞GS抗体表达阳性。流式细胞术双色分析结果显示，Brn3b和GS阳性细胞率分别为(13.00±3.06)%和(31.60±3.67)%。免疫荧光染色结果显示，体外培养的兔RGCs Brn3b抗体及Thy1.1抗体染色阳性。不同压力条件下RSCs及分化所得细胞的Nestin、Thy1.1 mRNA和蛋白相对表达量比较差异均有统计学意义(mRNA： F＝127.600、137.400，均 P<0.01；蛋白： F＝82.480、158.700，均 P<0.001)，其中与0 mmHg相比，20、40、60、80 mmHg条件下，Nestin mRNA及蛋白相对表达量降低，Thy1.1 mRNA及蛋白相对表达量增加，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。40 mmHg时，Nestin mRNA和蛋白相对表达量最低，Thy1.1 mRNA和蛋白相对表达量最高。 结论:在一定范围内，压力能够促进与RGCs共培养的RSCs分化成视网膜神经节样细胞，压力过大会抑制RSCs的分化。

目的:利用携带腺苷三磷酸结合盒转运子A3( ABCA3)复合杂合突变的新生儿呼吸窘迫综合征(NRDS)患儿的外周血单核细胞(PBMCs)，建立符合研究需求的诱导多能干细胞(iPSCs)细胞系。 方法:细胞实验研究。采集患儿的外周静脉血并分离出PBMCs，体外培养，用携带重编程因子的非整合性仙台病毒载体转染PBMCs，对所产生的iPSCs细胞系进行染色体核型分析。采用免疫荧光技术、流式细胞术检测干细胞多能性标志物、验证其分化潜能，采用Sanger测序对基因突变进行分析，另外还行短串联重复序列(STR)位点分析，聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳法检测病毒残留。结果:对建立的iPSCs细胞系行核型分析显示为正常的二倍体46，XY核型，免疫荧光技术显示干细胞多能性标志物OCT4、SSEA4、Nanog及Sox2染色呈阳性。流式细胞术检测干细胞多能性标志物，显示TRA-1-60、SSEA-4和OCT4的表达。诱导向三胚层分化后用免疫荧光技术对外胚层(PAX-6)、中胚层(Brachyury)和内胚层(甲胎蛋白)标志物进行免疫荧光染色，结果显示均为阳性。Sanger测序显示c.3997_3998del及c.3137C>T复合杂合突变。STR位点分析结果显示其来源于患儿PBMCs，PCR和琼脂糖凝胶电泳法未检测到仙台病毒残留。结论:本研究用 ABCA3复合杂合突变患儿的PBMCs建立了iPSCs细胞系，为 ABCA3基因突变所致的NRDS发病机制的研究、治疗药物筛选及细胞治疗奠定了基础。

目的:以诱导多能干细胞(iPSC)和倒置胶体晶体聚乙二醇支架(ICC)为基础构建乙型肝炎病毒(HBV)感染的肝脏类器官系统，并验证核苷类药物的抗病毒作用。方法:将iPSC分化诱导成肝细胞样细胞(HLC)，并接种至ICC中建立肝脏类器官系统。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Nanog同源框(NANOG)、性别决定区Y框(SOX)2、SOX17、叉头框蛋白A2(FOXA2)、甲胎蛋白、白蛋白的mRNA相对表达水平；应用激光共聚焦显微镜对类器官三维结构进行摄片；采用蛋白质印迹法和免疫荧光分析HLC中钠离子-牛磺胆酸共转运蛋白(NTCP)表达水平。HepG2.2.15细胞提取HBV病毒颗粒感染肝脏类器官，RT-qPCR法检测细胞内HBV前基因组RNA(pgRNA)相对表达量；激光共聚焦显微镜下观察细胞质中乙型肝炎核心抗原(HBcAg)和乙型肝炎表面抗原(HBsAg)表达。分别以0.5 μmol/L恩替卡韦、0.5 μmol/L拉米夫定干预HBV感染细胞，采用RT-qPCR法检测感染与未感染细胞内HBV pgRNA相对表达量。统计学分析采用独立样本 t检验和单因素方差分析。 结果:iPSC分化21 d内，干细胞标志物NANOG、SOX2 mRNA表达水平降低( F＝158.90、8.31， P<0.001， P＝0.002)，内胚层SOX17、FOXA2 mRNA表达水平先升高后降低( F＝37.23、82.57，均 P<0.001)；分化后期，肝细胞中甲胎蛋白、白蛋白mRNA表达水平升高( F＝4.65、34.64， P＝0.012， P<0.001)，差异均有统计学意义。蛋白质印迹法和荧光显微镜下显示分化后细胞中NTCP高表达，其蛋白质相对表达水平为0.803±0.099，激光共聚焦显微镜显示分化后肝细胞表达白蛋白，在ICC中呈现三维球体结构。HBV pgRNA表达和HBsAg、HBcAg的免疫染色证实HBV成功感染肝脏类器官系统。核苷类药物作用类器官系统3 d后，恩替卡韦组(0.665±0.220)和拉米夫定组(0.503±0.117)的HBV pgRNA水平较未感染细胞(3.347±0.454)明显下降，差异均有统计学意义( t＝10.53、12.72，均 P<0.001)。 结论:iPSC分化后表现出肝脏特异性基因白蛋白和NTCP，以iPSC和ICC构建的肝脏类器官系统具有人体肝脏功能，HBV能感染该系统，恩替卡韦、拉米夫定能有效抑制肝细胞中HBV复制。