目的 制备马来酸阿塞那平微乳凝胶剂(ASPM-Emulgel),并通过鼻腔给药评价其脑靶向性.方法 根据马来酸阿塞那平(ASPM)在不同种类油、乳化剂和助乳化剂中的平衡溶解度以及辅料相容性结果确定马来酸阿塞那平微乳(ASPM-Emul)的处方组成及用量,并以卡波姆 940 作为凝胶基质将ASPM-Emul制备成凝胶剂;考察ASPM-Emul的粒径分布及微观形态,通过Franz扩散池法比较ASPM-Emul与ASPM-Emulgel的体外释放速率以及在羊鼻黏膜的渗透性;采用在体蟾蜍上颚模型法考察ASPM-Emulgel的鼻腔纤毛毒性;评价ASPM-Emulgel经大鼠鼻腔给药的脑靶向性.结果 根据平衡溶解度和相容性结果,选择单亚油酸甘油酯、吐温 80 和二乙二醇单乙基醚分别作为ASPM-Emul的油相、乳化剂和助乳化剂,配比为 4 ∶ 4 ∶ 2;ASPM-Emul为淡蓝色半透明状微乳液,粒径为(73.6±7.4)nm,在透射电镜下可观察到微乳呈规则球形,均匀分散;体外释放及渗透结果显示,ASPM-Emul的释药速率较快,ASPM-Emulgel释药速率持续平缓,但两者在羊鼻黏膜中的渗透率基本一致;ASPM-Emul和ASPM-Emulgel对蟾蜍鼻腔纤毛无明显毒性;与尾静脉ASPM组相比,ASPM-Emul和ASPM-Emulgel经鼻腔给药后在大脑中的药物含量显著增高,均表现出明显的脑靶向性,且ASPM-Emulgel的脑靶向效率更高.结论 将ASPM制备成微乳凝胶剂,经鼻腔给药后可以显著提高药物的脑靶向性,有望提高马来酸阿塞那平的临床治疗效果.

蟾酥作为临床常用的动物药材,广泛用于心血管疾病、风湿和恶性肿瘤疼痛的治疗.因其具有高活性和高毒性的特点,关注蟾酥制剂中蟾酥药味的质量控制,对于保障临床用药的安全有效至关重要.通过梳理我国药品标准收载的蟾酥制剂情况,明确已批准上市的蟾酥制剂有 102 种 474 个批号,其中《中国药典》2020 年版收载 14 种,《中华人民共和国卫生部药品标准》收载 68 种.这些制剂中,蟾酥多以原粉入丸、散剂,功能主治主要集中在清热解毒、消肿止痛、益气活血、开窍醒脑等方面.除了 2020 年版《中国药典》收载的蟾酥制剂中蟾酥药味的质量控制水平相对较高以外,其他蟾酥制剂中蟾酥药味的质控标准均较低,甚至缺失,亟需进行蟾酥制剂的质量标准提升研究.进一步检索中国知网(CNKI)、PubMed、Web of Science,对国内外报道的蟾酥制剂的质量评价研究和质量控制现状进行归纳总结,有 64 种蟾酥制剂报道了定性定量分析方法,主要有薄层鉴别、HPLC指纹图谱和多成分含量测定,指标成分涉及日蟾毒它灵、沙蟾毒精、蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基等主要的蟾蜍甾类成分.综合文献信息,提示在完善蟾酥制剂质量标准过程中,需要关注蟾酥药材、饮片和制剂分析方法和检测指标的关联性,加强吲哚生物碱类成分的监控,以及重视含量均匀度检查等项目,以提升蟾酥制剂的整体质量控制水平.

目的 建立冻干蟾皮凝胶剂质量标准和初步药效学研究.方法 采用薄层色谱(TLC)法对制剂中的华蟾酥毒基和酯蟾毒配基进行定性鉴别,高效液相色谱(HPLC)法测定华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量,色谱柱kromasilC18(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相:乙腈(A)-水(B)(48∶52);流速:1 mL/min;检测波长:296 nm;柱温:30℃;进样量:10μL.采用S180腹水型实体瘤小鼠进行初步抑瘤药效学研究.结果 硅胶G薄层板上,在与对照品色谱对应的位置上,显示相同颜色的荧光斑点,且斑点大小适中,分离度良好.华蟾酥毒基和酯蟾毒配基分别在0.056～4.48 μg/mL,0.256～10.24 μg/mL范围内,峰面积与浓度存在良好的线性关系(r=0.9987、0.9996).加样回收率(n=6)为100.27％、101.68％,相对标准偏差为1.56％、1.67％.初步药效学结果显示冻干蟾皮凝胶剂不同剂量组均有显著抗肿瘤作用,且高剂量组效果最佳,抑瘤率为48.03％.结论 建立了冻干蟾皮凝胶剂质量标准,初步药效学表明冻干蟾皮凝胶剂具有显著抗肿瘤作用.

目的 考察蟾酥Bufonis venenum鲜浆干燥炮制加工(日晒干燥、50℃真空干燥、50℃鼓风干燥、80℃鼓风干燥、冷冻干燥)前后化学成分及药效变化.方法 HPLC法和TLC法研究蟾酥不同干燥方式炮制前后化学成分的变化,MTT法测试不同炮制干燥品抑制5种不同肿瘤细胞株增殖的效果.结果 5种不同加工炮制方法所得蟾酥,性状有较大差异;化学成分的种类及含量没有明显差异;华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量之和都符合《中国药典》2015年版标准,大于6％;50℃和80℃鼓风干燥所得蟾酥具有比其他干燥方法更强的肿瘤细胞抑制效果.结论 日晒及50℃鼓风干燥法所得蟾酥符合《中国药典》要求的外观性状.真空干燥和冷冻干燥虽然颜色不符合《中国药典》的规定,但主要有效成分并未发生较大变化.

目的 探讨华蟾毒配基通过改变表观遗传修饰调控肝癌细胞死亡的机制.方法 通过CCK-8法检测不同浓度(0、0.75、1.5、2.5、5、10 μmol/L)华蟾毒配基作用于肝癌HepG2细胞24 h细胞增殖能力的变化;5μmol/L华蟾毒配基作用HepG2细胞12、24 h后,流式细胞术检测细胞周期,蛋白印迹检测钙/钙调素依赖蛋白激酶2β(CaMK2B)、甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)、磷酸化MeCP2(p-MeCP2)、乙酰化组蛋白H3.1 (Ac-Histone3.1)和甲基化组蛋白(Met-Histone3.1)的表达变化;5μmol/L华蟾毒配基作用HepG2细胞24 h后,细胞免疫荧光结合扫描共聚焦检测CaMK2B和MeCP2相互作用.结果 华蟾毒配基能显著抑制肝癌HepG2细胞生长,抑制效果呈现浓度依赖性,差异有统计学意义(P＜0.05),药物作用细胞后,细胞周期发生G2/M期阻滞,差异有统计学意义(P＜0.05).5μmol/L华蟾毒配基可促进CaMK2B和MeCP2在细胞核内结合,Western blot结果显示华蟾毒配基作用HepG2细胞后上调CaMK2B和p-MeCP2表达(P＜0.05),抑制Ac-Histone3.1表达,促进Met-Histone3.1 (P＜0.05).结论 华蟾毒配基通过激活CaMK2B-MeCP2信号通路抑制组蛋白乙酰化、促进甲基化继而诱导肝癌细胞死亡.

[目的]筛选对蟾皮华蟾毒配基组分增效减毒的配伍药物并考察该方剂体外对肿瘤细胞及正常细胞的活性影响.[方法]利用析因设计(24)和正交设计L(9 34)优化蟾皮华蟾毒配基组分、五味子组分、黄芪组分和甘草酸之间的配伍关系.利用细胞增殖与毒性检测(CCK-8)法检测该方剂对SW620、L02、人细胞因子诱导性杀伤T细胞(CIK细胞)在不同时间点的细胞存活率,并进一步考察其对L02细胞释放丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的影响.[结果]析因设计确定了4种药物间有交互效应并确定本方剂由4种药味组成;正交设计进一步优选出配伍剂量:蟾皮华蟾毒配基组分2 μg/mL,五味子组分10 μg/mL,黄芪组分5 μg/mL,甘草酸10 μg/mL.组方完成后将该方剂命名蟾五草组分散.与蟾皮华蟾毒配基组分相比,蟾五草组分散能降低SW620细胞存活率,而增加L02、CIK细胞存活率;另外,能降低L02细胞释放ALT.[结论]配伍合理的蟾五草组分散实现了对蟾皮华蟾毒配基组分的增效减毒.

目的 研究华蟾毒配基联合索拉非尼对肝癌Huh7细胞增殖与凋亡的影响及作用机制.方法 MTT法检测Huh7细胞增殖;Hoechst33342/PI荧光双染法检测Huh7细胞凋亡形态变化;流式细胞仪检测细胞周期;免疫细胞化学法检测Ki67蛋白表达;Western blotting法检测Bax、Bcl-2、Caspase-8、极光激酶A(AURKA)、Ras、Raf、细胞外调节蛋白激酶(ERK)和p-ERK蛋白的表达变化.结果 华蟾毒配基、索拉非尼及联合用药对Huh7细胞的增殖均有抑制作用,联合用药组的增殖抑制作用更明显,具有协同效应;荧光染色可见细胞凋亡形态变化;索拉非尼引起Huh7细胞周期S期阻滞,华蟾毒配基和联合用药引起Huh7细胞周期GE/M期阻滞,联合用药组G2/M期阻滞较单药组更明显;华蟾毒配基和索拉非尼均能减弱Ki67表达,联合用药组的作用更为显著;华蟾毒配基、索拉非尼及联合用药上调Bax和Caspase-8蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,上调Bax/Bcl-2比例,对ERK蛋白表达无明显影响,显著下调AURKA、Ras、Raf和p-ERK蛋白表达,联合用药组的作用更为显著(P＜0.05).结论 华蟾毒配基联合索拉非尼通过AURKA/Ras/Raf/ERK信号通路抑制肝癌Huh7细胞增殖,诱导其凋亡.

目的:研究不同产地、不同生长年限的蟾蜍类药材质量均一性.方法:用高效液相色谱法测定12份蟾蜍类药材样品中蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基,4种指标成分含量.结果:各样品中均可检测出4种指标成分,不同产地蟾酥、干蟾、蟾衣药材间品质差异较大;干蟾样品中4种指标成分含量,小的干蟾个体明显高于大的干蟾个体样品;蟾衣样品中,脂蟾毒配基含量:蟾衣(大)<蟾衣(小),蟾毒灵含量:蟾衣(小)<蟾衣(大).结论:本实验为合理开发、应用蟾蜍类药材资源提供理论和实验依据.

蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans或黑眶蟾蜍B.melanostictus耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物.目前商品蟾酥质量问题突出,混伪、掺假现象普遍存在.亟需构建科学完善的质量控制方法,以提升蟾酥药材、饮片及其中成药制剂的质量控制水平,保障临床用药安全有效.该研究采用高效液相色谱法建立蟾酥药材的特征图谱,采用一测多评法(QAMS)测定5种主要蟾毒配基的含量.通过不同批次市售蟾酥样品的分析,建立了以五羟色胺、日蟾毒它灵、沙蟾毒精、嚏根草配基、远华蟾毒精、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为特征峰的对照特征图谱;建立了以华蟾酥毒基为内参物,同步测定蟾酥药材中5种蟾毒配基含量的一测多评法,并对相对校正因子(RCF)的耐用性和系统适用性进行了系统研究.华蟾酥毒基对日蟾毒它灵、蟾毒它灵、蟾毒灵和脂蟾毒配基的RCF分别为1.05,0.895,1.09,0.913.建立的特征图谱和QAMS法,可以有效控制蟾酥药材的质量,为2020年版《中国药典》蟾酥药材质量标准的完善与提高提供参考.

目的 优化蟾酥中脂溶性成分华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的提取及纯化工艺.方法 以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基总量为考察指标,以乙醇浓度、溶剂倍量、提取时间为考察因素,采用正交试验确定最佳提取工艺参数;通过单因素考察并结合Box-Behnken响应面法,以展开剂比例、柱高与直径比、吸附剂与上样量的比值为考察因素,筛选并确定最佳纯化工艺.结果 确定最佳提取工艺为加入10倍量85％的乙醇提取90 min;最佳纯化工艺为展开剂环己烷-氯仿-丙酮(4∶3∶3),柱高与直径比为7∶1,吸附剂-上样量为5.5∶1,2种蟾毒配基纯化后的总量可达66.51％.通过3批放大工艺验证,表明模型拟合度良好,采用硅胶柱色谱分离纯化蟾毒配基,具有操作简便、分离速度快、分离效果好等优点.结论 所选工艺合理、可行,为以后该产品的产业化应用提供技术参考和依据.