钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)是近年来常见的心血管疾病之一,其具体的发病机制尚不明确.瓣膜内皮细胞(VEC)是维持主动脉瓣稳态的屏障,机械力学因素、一氧化氮代谢障碍、氧化应激、脂质沉积和炎症均可引起VEC损伤,导致主动脉瓣钙化.此外,VEC还可以通过一氧化氮或内皮间充质转化来调节瓣膜间质细胞,影响主动脉瓣钙化的过程.该文总结了近年来VEC对CAVD的影响调控机制,为CAVD的治疗提供参考.

目的 探讨miR-761对钙化性主动脉瓣膜疾病(calcified aortic valve disease,CAVD)的影响及其潜在机制.方法 于2022年1月至2023年1月从重庆医科大学附属第一医院心胸外科收集正常(6例)和钙化(8例)的瓣膜组织,采用Western blot、免疫组织化学染色和RT-qPCR检测钙化瓣膜组织中自噬基因、成骨基因、γ-氨基丁酸受体相关蛋白(Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein,GAB ARAP)或miR-761表达的变化;双荧光素酶实验验证miR-761与GABARAP 3'-UTR区的结合;通过细胞免疫荧光实验对分离的猪主动脉瓣膜间质细胞(porcine aortic valve interstitial cells,pVICs)进行表型鉴定;在pVICs中转染miR-761 mimic、inhibitor以及相应的对照构建过表达或敲低miR-761的pVICs细胞系,加入GFP-LC3腺病毒后观察自噬小体数量的变化.成骨培养基(osteogenic medium,0M)处理pVICs前后分别采用Western blot、碱性磷酸酶染色和茜素红S染色检测pVICs的成骨分化能力.结果 与正常组织比较,钙化瓣膜组织中α-SMA、RUNX2、Beclin 1、ULK1和GABARAP蛋白表达上调,p62蛋白、miR-761表达下调(P＜0.05);双荧光素酶实验验证了 miR-761与GABARAP 3'-UTR区的结合(P＜0.05);分离出的pVICs表达间质细胞标记物α-SMA、Vimentin,不表达内皮细胞标记物CD31;共聚焦显微镜结果显示,敲低miR-761使pVICs的自噬小体生成增多;此外,蛋白、碱性磷酸酶染色、茜素红S染色结果均显示,敲低miR-761显著增加pVICs中的GABARAP的表达,显著降低OPN、α-SMA、RUNX2、Collagen Ⅰ的表达(P＜0.05),抑制OM诱导的细胞钙盐沉积.结论 miR-761可能通过抑制GABARAP的表达抑制自噬,促进心脏瓣膜钙化.

钙化性主动脉瓣膜病(calcific aortic valve disease,CAVD)是以主动脉瓣钙化重构引起主动脉瓣狭窄(aortic stenosis,AS),导致血流动力学紊乱的一种慢性进行性疾病.其发病与衰老有关,发病率及严重程度随年龄的增加而增加[1-2].流行病学显示,钙化性主动脉瓣膜病患者在≥65岁人群中占26％,75～84岁人群中占35％,≥85岁高达50％[3].因发病机制尚不明确,手术是唯一治疗手段.昂贵的手术费用将给人口老龄化国家造成沉重医疗负担.因此探明CAVD的病因及发病机制,寻找有效的治疗药物,具有重要意义.

目的 分析心脏手术体外循环中搏动和平流灌注模式下,血流携带能量的大小及对血管内皮细胞功能的影响.方法 选取2017年1月至2017年7月本院因单纯心脏二尖瓣病变拟行心脏瓣膜替换或成形手术患者40例,随机分为搏动灌注(PP)和平流灌注(NP)两组,通过能量等效压(EEP)和附加血流动力学能量(SHE)计算搏动和平流两种灌注模式在主动脉阻断后即刻、10 min、20 min、30 min和开放前各时间点血流能量的大小,并检测麻醉诱导后(T1)、主动脉阻断后30 min(T2)、停机后30 min(T3)和术后6 h(T4)内皮素-1(ET-1)、一氧化氮(NO)、白细胞介素(IL)-6、IL-10和肿瘤坏死因子(TNF)的变化,研究搏动灌注能量传递效率对血管内皮功能和全身炎症反应的影响.结果 主动脉阻断后,PP组各时段EEP和SHE明显高于NP组;ET-1在T2和T3时点PP明显高于NP组;IL-10在T2、T3和T4时点PP组明显低于NP组;组内比较,各细胞因子与基础值(T1)相比均有显著差异;术中尿量PP组明显多于NP组[(672.71±310.55) ml vs(397.79±171.74)ml];两组肌酐、尿素氮无显著差异.结论 与平流模式体外循环相比较,体外循环中采用有效搏动灌注赋予血流更多能量,这些能量作用于血管内皮细胞可能影响内皮因子和炎性因子的分泌.

目的:检测NADPH氧化酶(Nox)在正常猪主动脉瓣膜及培养的瓣膜间质细胞和内皮细胞中的表达.方法:把猪主动脉瓣膜分为尖部、中部和根部,并从完整瓣膜中分离培养瓣膜间质细胞和内皮细胞.通过免疫荧光法鉴定间质细胞和内皮细胞的表型及组织中Nox主要亚型Nox2和Nox4的表达,采用Real-time PCR和Western blot方法检测瓣膜尖部、中部和根部以及间质细胞和内皮细胞中Nox2和Nox4的表达.结果:与尖部和中部相比,猪主动脉瓣膜根部Nox2和Nox4蛋白表达水平升高(P<0.05);内皮细胞中Nox4 mRNA和蛋白的表达水平高于间质细胞(P<0.05),但间质细胞中Nox2蛋白表达水平高于内皮细胞(P<0.05).结论:Nox在猪主动脉瓣膜的生理性表达具有组织和细胞特异性.

钙化性主动脉瓣膜病(CAVD)是一种炎症相关的疾病,目前缺乏有效的药物干预措施.白细胞介素(IL)-17A作为T细胞分泌的一种前炎症细胞因子参与并调节机体的多种炎症相关性疾病,但在CAVD中的作用机制尚不明确.本研究前期研究发现,CAVD组瓣膜中IL-17A/IL-17RA信号通路被激活,且相关报道证明IL-17A能够激活IL-17RA并诱导内皮细胞凋亡.因此,推测IL-17A/IL-17RA信号通路可能通过损伤瓣膜内皮、间质细胞,加重炎症细胞浸润及成骨分化等过程导致瓣膜钙化.本项目中拟检测人体瓣膜标本、利用IL-17A-/-/ApoE-/-双敲小鼠模型,探讨IL-17A/IL-17RA信号通路激活导致主动脉瓣钙化的机制,为主动脉瓣钙化发病机制提供新的理论依据,为临床防治提供新的靶点.

钙化性主动脉瓣疾病是一个涉及内皮损伤、慢性炎症、细胞外基质重塑、细胞表型分化及细胞凋亡等复杂病理变化的过程.主动脉瓣主要由内部的瓣膜间质细胞及其表面覆盖的瓣膜内皮细胞构成,此两类细胞均参与了钙化性主动脉瓣疾病的病理进程.非编码RNA主要通过转录后调控机制参与心血管疾病病理生理过程,可能在钙化性主动脉瓣疾病的发生、发展中起着重要作用.

目的:探讨胶原酶消化法分离猪主动脉瓣内皮细胞的可靠性及可重复性.方法:通过胶原酶消化法从新鲜猪主动脉瓣膜表面分离并培养主动脉瓣内皮细胞,通过免疫荧光染色法和流式细胞仪对获得的瓣膜内皮细胞(VEC)的表型加以鉴定.结果:通过胶原酶消化法可成功分离VEC,光镜下VEC呈铺路石样分布,为典型的内皮细胞形态.免疫荧光染色示VEC的CD31表达为阳性,波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达为阴性,分离获得的细胞中VEC阳性率高,间质细胞污染率较低;流式细胞仪示分离获得的细胞Vimentin表达阴性(3.06％),CD31表达阳性(99.01％),再次验证分离获得的VEC纯度高.结论:胶原酶消化法可从猪主动脉瓣膜分离获得纯度较高的V EC,该方法简单,可重复性好.

该文的主要目的是探究过表达自噬相关蛋白Atg5对主动脉瓣膜间质细胞自噬水平以及成骨样分化能力的影响,为钙化性主动脉瓣膜疾病的研究提供新方法和新思路.从猪主动脉瓣上分离原代瓣膜间质细胞,细胞免疫荧光进行表型鉴定后,采用成骨培养基诱导瓣膜间质细胞成骨分化,并用Western blot检测细胞成骨指标Runx2、OPN与自噬指标p62和LC3B-Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达水平;构建重组质粒pAdTrack-ATG5并通过脂质体转染瓣膜间质细胞,采用Q-PCR、Western blot以及免疫荧光染色检测转染后细胞Atg5的表达水平和细胞自噬水平的变化情况;对成骨诱导培养的主动脉瓣膜间质细胞分别转染空载质粒和过表达Atg5质粒,利用Western blot检测72 h后瓣膜间质细胞早期成骨指标Runx2、OPN的表达,并用碱性磷酸酶染色和茜素红S染色方法检测瓣膜间质细胞晚期成骨样分化能力.结果 显示,原代分离培养的瓣膜间质细胞的间质细胞标志物α-SMA和vimentin的染色结果呈阳性,内皮细胞标志物vWF的染色结果呈阴性;与对照组比较,用成骨培养基培养的瓣膜间质细胞Runx2、OPN和p62的蛋白表达水平显著上调,LC3B-Ⅱ/Ⅰ的比值显著下调;测序结果显示,过表达质粒pAdTrack-ATG5构建成功;在转染pAdTrack-ATG5后,细胞Atg5的基因表达水平和蛋白表达水平均显著上调,自噬指标p62蛋白表达水平显著下调,LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值显著上调,免疫荧光染色显示,LC3B聚集增加;与转染空载质粒组相比,转染pAdTrack-ATG5组细胞在成骨培养基培养72 h后成骨指标Runx2、OPN的蛋白表达水平显著下降,转染pAdTrack-ATG5组碱性磷酸酶染色和茜素红S染色结果的阳性程度均弱于转染空载质粒组.综上所述,过表达Atg5能上调细胞自噬水平,并抑制瓣膜间质细胞成骨样分化.

我们将经过戊二醛（GA）和GA+环氧氯丙烷（EC）化学改性处理的猪主动脉瓣，再用L—谷胺酸处理以后进行SD乳鼠主动脉内皮细胞种植，并与单纯GA瓣及未经GA处理的瓣叶做对比观察。结果发现：单纯GA瓣种植细胞未能存活，而经L—谷胺酸处理瓣叶却获得种植细胞规律性生长、增殖，两周后完全覆盖瓣叶表面。电镜观察及第Ⅷ因子染色证实，瓣小叶表面生长的内皮细胞中夹杂着大量成纤维细胞生长。与种植前培育细胞纯化及种植以后成纤维细胞控制不够有关。