目的:探讨微小RNA-22(miR-22)对瓣膜间质细胞成骨分化的作用及其在主动脉瓣钙化发生发展中的作用。方法:以主动脉瓣置换术中切除的钙化性主动脉瓣疾病15例，其中钙化主动脉瓣组织作为实验组，正常主动脉瓣组织为对照组；苏木精-伊红(HE)染色、VonKossa法观察瓣膜钙化程度；实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)、免疫荧光试验检测瓣膜组织中miR-22的表达变化和蛋白表达水平。组间比较采用方差分析。结果:HE染色以及Von Kossa钙沉积染色提示实验组中有大量羟基磷灰石沉积；免疫组织化学染色结果显示实验组Runx相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)的阳性表达。相较对照组，实验组miR-22基因表达明显升高( P<0.01)，实验组成骨相关基因Runx2高于对照组(1.39±0.02比1.09±0.01， F＝4.00， P<0.01)；实验组成骨相关基因OCN高于对照组(0.92±0.03比0.58±0.02， F＝2.250， P<0.01)，实验组去乙酰化转移酶6(HDAC6)低于对照组(1.09±0.05比1.52±0.04， F＝1.563， P<0.01)。双荧光素报告基因检测和Western blot检测结果显示miR-22过表达可以显著增加成骨相关基因的表达；过表达miR-22显著减低HDAC6的表达。 结论:miR-22通过抑制HDAC6的表达促进Runx2、OCN的表达和活性，瓣膜间质细胞成骨分化，参与主动脉瓣膜钙化进程。

目的:探讨Ras超家族亚群A(RhoA)/Rho关联含卷曲螺旋结合蛋白激酶1(Rock-1)在无机磷酸盐中诱导大鼠瓣膜间质细胞(VICs)成骨分化的作用机制。方法:取8只雄性大鼠(购自上海西普尔必凯动物实验有限公司)的主动脉瓣膜消化培养至第3代后免疫荧光鉴定。小干扰RNA(siRNA)-RhoA转染VICs后用无机磷酸盐成骨培养基(IP-OIM)分别诱导转染组(RNAi)，阴性对照组(NC)及空白对照组(CON)的成骨分化，并通过蛋白质印迹法(Western blot)与聚合酶链反应(PCR)评估转染后RhoA、Rock-1、Runt相关转录因子2(Runx-2)及骨钙素(OST)的变化；7 d行碱性磷酸酶(ALP)活性相关检测，14 d行钙含量相关检测评估其早期与晚期成骨分化趋势。用IP-OIM刺激转染后的VICs 60 min，并通过Western blot检测SMAD1/5/9的磷酸化变化。采用单因素方差分析。结果:鉴定后的VICs转染siRNA-RhoA并用IP-OIM培养，经过Western blot及PCR检测后可知RNAi的RhoA(Western blot：0.330±0.020；PCR：0.357±0.060)及Rock-1(Western blot：0.366±0.020；PCR：0.383±0.040)比CON均出现表达下调(RhoA Western blot： t＝36.680， P<0.05 PCR： t＝10.610， P<0.05；Rock-1 Western blot： t＝31.240， P<0.05 PCR： t＝13.210， P<0.05)，差异有统计学意义，RNAi的OST(Western blot：0.520±0.030；PCR：0.510±0.070)和Runx-2(Western blot：0.573±0.020；PCR：0.57±0.060)比CON也出现了下降(OST Western blot： t＝16.630， P<0.05；PCR： t＝6.970， P<0.05；Runx-2 Western blot： t＝21.040， P<0.05；PCR： t＝6.710， P<0.05)，差异有统计学意义。在7 d的ALP染色中RNAi的颜色最浅，ALP活性检测中RNAi [(1.005±0.101) U/mg]活性比较NC[(2.042±0.116) U/mg]和CON[(1.931±0.136) U/mg]明显下降( t＝10.570， P<0.05； t＝9.400， P<0.05)，差异有统计学意义。在14 d的相对钙含量测定中RNAi[(22.290±1.981) ng/L]钙含量比较NC[(41.100±2.440) ng/L]和CON[(41.760±1.215) ng/L]明显下降( t＝10.530， P<0.05； t＝14.510， P<0.05)，差异有统计学意义；同样茜素红钙沉积染色中，也是RNAi颜色最浅。经IP-OIM分别刺激60 min，RNAi的SMAD1/5/9的磷酸化水平(0.337±0.030)比CON明显下降( t＝25.480， P<0.05)，差异有统计学意义。 结论:无机磷酸盐可通过RhoA/Rock-1引起瓣膜间质细胞的成骨分化，SMAD1/5/9的磷酸化在此过程中起重要作用。

目的:探讨自噬对于风湿性心脏病的瓣膜间质细胞(VICs)生物学特征改变以及增殖能力的影响。方法:使用肝素诱导人主动脉瓣膜间质细胞(购自上海赛百慷生物技术股份有限公司)向肌成纤维细胞分化，而后使用自噬抑制剂LY294002(15 μmol/L)进行干预，将细胞分为对照组、抑制剂组、诱导组、实验组。使用蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、碱性磷酸酶(ALP)、Beclin1、微管相关蛋白轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)蛋白表达水平；采用细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)分析自噬对4组细胞增殖的影响。结果:蛋白印记结果显示对照组的ALP和α-SMA蛋白(0.827±0.123、0.716±0.141)显著低于诱导组(1.384±0.165、1.315±0.223)，差异有统计学意义( t＝4.669， P<0.01、 t＝3.929， P<0.05)；对照组Beclin1和LC3-Ⅱ(0.807±0.182、0.392±0.150)显著低于诱导组(1.271±0.067、1.404±0.018)，差异有统计学意义( t＝4.131， P<0.05、 t＝11.535， P<0.01)；诱导组的ALP和α-SMA蛋白(1.385±0.165、1.447±0.014)显著高于实验组(0.939±0.189、0.907±0.324)，差异有统计学意义( t＝2.882， P<0.05)。CCK-8细胞增殖实验结果显示各组VICs细胞的细胞活力差异有统计学意义( F＝545.843， P<0.01，η 2＝0.986)，对照组细胞活力显著高于诱导组，差异有统计学意义( t＝29.753， P<0.01， d＝1.101)；实验组细胞活力也显著高于诱导组，差异有统计学意义( t＝14.034， P<0.01， d＝0.878)。 结论:自噬促进风湿性心脏病瓣膜间质细胞分化，同时抑制其细胞活性。

目的:探讨CC趋化因子受体2(CCR2)在瓣膜间质细胞成骨转化中的作用及其机制。方法:2020年6月东南大学附属中大医院实验室通过胶原酶消化法改良后实施体外分离大鼠瓣膜间质细胞后进行培养、鉴定，并以随机抽签法将细胞分成试验组及对照组。对照组细胞培养基中加入2 ml的RPMI 1640完全培养液，试验组细胞培养基中则加入RPMI 1640完全培养液以及1.0 ng/ml的MCP-1。比较两组细胞中CCR2蛋白表达水平，碱性磷酸酶(ALP)、骨形态发生蛋白(BMP)-2蛋白与内参灰度比值，ALP、BMP-2基因与内参灰度比值，采用Pearson法进行相关性的分析。结果:试验组细胞中CCR2蛋白表达水平高于对照组(1.549±0.392比0.742±0.257， t＝5.444， P<0.05)。试验组ALP蛋白与内参灰度比值明显高于对照组(0.732±0.052比0.189±0.029， t＝28.840， P<0.05)。试验组BMP-2蛋白与内参灰度比值明显高于对照组(0.891±0.058比0.401±0.033， t＝23.220， P<0.05)。试验组ALP基因与内参灰度比值明显高于对照组(0.248±0.006比0.104±0.003， t＝67.882， P<0.05)。试验组BMP-2基因与内参灰度比值明显高于对照组(0.518±0.048比0.198±0.039， t＝16.362， P<0.05)。CCR2蛋白表达量与ALP蛋白和内参灰度比值( r＝0.513， P<0.05)、BMP-2蛋白和内参灰度比值( r＝0.513， P<0.05)、ALP基因和内参灰度比值( r＝0.602， P<0.05)、BMP-2基因和内参灰度比值( r＝0.616， P<0.05)均呈正相关关系。 结论:CCR2可促进瓣膜间质细胞向成骨样细胞转化。

钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)是近年来常见的心血管疾病之一,其具体的发病机制尚不明确.瓣膜内皮细胞(VEC)是维持主动脉瓣稳态的屏障,机械力学因素、一氧化氮代谢障碍、氧化应激、脂质沉积和炎症均可引起VEC损伤,导致主动脉瓣钙化.此外,VEC还可以通过一氧化氮或内皮间充质转化来调节瓣膜间质细胞,影响主动脉瓣钙化的过程.该文总结了近年来VEC对CAVD的影响调控机制,为CAVD的治疗提供参考.

目的 探讨miR-761对钙化性主动脉瓣膜疾病(calcified aortic valve disease,CAVD)的影响及其潜在机制.方法 于2022年1月至2023年1月从重庆医科大学附属第一医院心胸外科收集正常(6例)和钙化(8例)的瓣膜组织,采用Western blot、免疫组织化学染色和RT-qPCR检测钙化瓣膜组织中自噬基因、成骨基因、γ-氨基丁酸受体相关蛋白(Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein,GAB ARAP)或miR-761表达的变化;双荧光素酶实验验证miR-761与GABARAP 3'-UTR区的结合;通过细胞免疫荧光实验对分离的猪主动脉瓣膜间质细胞(porcine aortic valve interstitial cells,pVICs)进行表型鉴定;在pVICs中转染miR-761 mimic、inhibitor以及相应的对照构建过表达或敲低miR-761的pVICs细胞系,加入GFP-LC3腺病毒后观察自噬小体数量的变化.成骨培养基(osteogenic medium,0M)处理pVICs前后分别采用Western blot、碱性磷酸酶染色和茜素红S染色检测pVICs的成骨分化能力.结果 与正常组织比较,钙化瓣膜组织中α-SMA、RUNX2、Beclin 1、ULK1和GABARAP蛋白表达上调,p62蛋白、miR-761表达下调(P＜0.05);双荧光素酶实验验证了 miR-761与GABARAP 3'-UTR区的结合(P＜0.05);分离出的pVICs表达间质细胞标记物α-SMA、Vimentin,不表达内皮细胞标记物CD31;共聚焦显微镜结果显示,敲低miR-761使pVICs的自噬小体生成增多;此外,蛋白、碱性磷酸酶染色、茜素红S染色结果均显示,敲低miR-761显著增加pVICs中的GABARAP的表达,显著降低OPN、α-SMA、RUNX2、Collagen Ⅰ的表达(P＜0.05),抑制OM诱导的细胞钙盐沉积.结论 miR-761可能通过抑制GABARAP的表达抑制自噬,促进心脏瓣膜钙化.

目的 观察抑制长链非编码RNA PANDA(LncRNA PANDA)表达对人心脏瓣膜间质细胞(hVICs)钙化的影响,并探讨其机制是否与核酸转录因子YA(NF-YA)、凋亡相关蛋白Bax、锚定蛋白2(Notch2)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)有关.方法 将体外培养的hVICs分为三组,正常对照组加入间质细胞培养基+10%胎牛血清,培养7 d;钙化组加入钙化诱导液,培养7 d.PANDA-siRNA组加入钙化诱导液培养3 d后,采用Lipofectamine?3000转染试剂盒转染PANDA-siRNA,再培养4 d.取各组分组培养7 d的细胞,采用实时荧光定量PCR法检测LncRNA PANDA相对表达量,光学显微镜观察细胞形态,Western blotting法检测NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2蛋白相对表达量,ELISA法检测细胞上清液BMP-2水平.结果 PANDA-siRNA组、正常对照组、钙化组细胞LncRNA PANDA相对表达量及上清液BMP-2蛋白水平均依次升高,组间两两比较P均<0.05.PANDA-siRNA组细胞结构清晰,呈条索状生长,生长稍缓慢;钙化组细胞成骨样改变,细胞聚集,呈网状结构;正常对照组细胞贴壁生长,生长迅速.与正常对照组比较,钙化组细胞NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2蛋白相对表达量均升高,PANDA-siRNA组均降低(P均<0.05).结论 诱导钙化后的hVICs LncRNA PANDA表达升高,抑制LncRNA PANDA表达可减轻其成骨样改变,其机制可能与降低NF-YA、Bax、Notch2、BMP-2表达有关.

钙化性主动脉瓣膜病(calcific aortic valve disease,CAVD)是以主动脉瓣钙化重构引起主动脉瓣狭窄(aortic stenosis,AS),导致血流动力学紊乱的一种慢性进行性疾病.其发病与衰老有关,发病率及严重程度随年龄的增加而增加[1-2].流行病学显示,钙化性主动脉瓣膜病患者在≥65岁人群中占26％,75～84岁人群中占35％,≥85岁高达50％[3].因发病机制尚不明确,手术是唯一治疗手段.昂贵的手术费用将给人口老龄化国家造成沉重医疗负担.因此探明CAVD的病因及发病机制,寻找有效的治疗药物,具有重要意义.

目的 探究细胞外酸碱环境对主动脉瓣膜间质细胞钙化的影响及相关机制.方法 主动脉瓣膜来源于2017年1—6月在第二军医大学附属长海医院心血管外科接受心移植手术的患者,采用二次胶原酶消化法分离主动脉瓣膜间质细胞,采用细胞免疫荧光法和流式细胞术鉴定主动脉瓣膜间质细胞.将传代的主动脉瓣膜间质细胞随机分为A、B、C、D 4组,A组采用普通培养基培养,pH值为7.4,B、C、D组均采用普通培养基+钙化培养基培养,pH值分别为7.1、7.4、7.7.采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测4组细胞骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Runt相关转录因子2(Runx2)和碱性磷酸酶(ALP)mRNA表达情况,采用Western Blot法检测4组细胞BMP-2、Runx2蛋白表达情况,采用比色法检测4组细胞ALP活性,采用茜素红染色观察4组细胞钙化结节情况.结果 (1)细胞免疫荧光法检测结果显示,波形蛋白(Vimentin)阳性率接近100%.流式细胞术检测结果显示,细胞CD31阳性率为1.17%.(2)将A组作为对照,C、D组细胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相对表达量高于B组,D组细胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA相对表达量高于C组(P<0.05).(3)B、C、D组细胞BMP-2、Runx2蛋白相对表达量高于A组,C、D组细胞BMP-2、Runx2蛋白相对表达量高于B组,D组细胞BMP-2、Runx2蛋白相对表达量高于C组(P<0.05).(4) B、C、D组细胞ALP活性高于A组,C、D组细胞ALP活性高于B组,D组细胞ALP活性高于C组(P<0.05).(5)茜素红染色结果显示,A组细胞钙化结节较少,B、C、D组细胞钙化结节逐渐增多;与C组相比,B组钙化结节明显减少,D组钙化结节明显增多.结论 细胞外酸性环境可抑制主动脉瓣膜间质细胞钙化,碱性环境则可促进主动脉瓣膜间质细胞钙化,其机制可能与细胞外酸碱环境影响BMP-2信号通路有关.

钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)曾被认为是被动的退行性病变,但近来的研究结果显示钙化进程是一个主要由主动脉瓣瓣膜间质细胞(AVICs)主动调控的过程.瓣膜间质细胞(VICs)存在于瓣叶组织中,其主要的功能是维持瓣叶生物功能的稳定.VICs在体外培养时可以发生表型转化,转变为成骨细胞样细胞并形成钙化结节,且多种因素可以调控这一钙化进程.本文将对CAVD的细胞模型作一综述.