为全面了解人中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂(human neutrophil elastase inhibitor,HNEI)的研究现状和临床应用前景,查阅2011年及以后发现的HNEI及人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophil elastase,HNE)参与肺部外疾病的文献,并进行归纳整理.结果发现,2011年以来出现了许多选择性高、抑制作用强的HNEI.HNE参与许多疾病的发生,除过去报道较多的传染性和炎症性肺部疾病外,还与局部缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎、自身免疫性糖尿病、肾炎、癌症的发生发展等疾病有关.开发高效低毒的HNE抑制剂已成为治疗相关疾病的重要方向.

目的 探讨枇杷叶提取物体内外对人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)的抑制作用.方法 运用醇提方法获得枇杷叶提取物,测定其中总三萜成分的含有量.建立体外HNE抑制活性模型和体内烟雾致小鼠急性肺损伤模型,观察枇杷叶提取物通过HNE抑制通路对急性肺损伤的修复作用.结果 枇杷叶提取物中总三萜含有量达到50.33％.体外实验中,枇杷叶提取物在质量浓度0.5～ 50.0μg/mL范围内,对HNE的抑制活性呈质量浓度依赖性,IC50为3.79 μg/mL.在50、100、150 mg/kg 3个剂量下,枇杷叶提取能显著降低肺泡液TNF-α和小鼠中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)水平.结论 枇杷叶提取物可以通过抑制HNE的活性来降低急性肺损伤的程度.

目的 从美洲钩虫 (Necator americanus) cDNA中扩增编码NaKuI10基因片段, 构建原核表达系统, 重组表达并纯化rNaKuI10, 采用化学发色法和平板溶解试验等检测其对有关丝氨酸蛋白酶的抑制作用及纤溶活性.方法 根据GenBank MH218867序列, 从美洲钩虫cDNA中扩增出编码成熟肽NaKuI10基因片段并连接入表达载体, 构建原核表达重组质粒pET32a-sumo/NaKuI10, 鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 中, 用IPTG诱导表达, 超声破碎细菌后用镍亲和层析纯化表达产物, 在纯化柱上用SUMO蛋白酶切割融合标签获得rNaKuI10, 用发色底物法检测rNaKuI10对各丝氨酸蛋白酶的抑制活性, 通过纤维蛋白平板法和纤维蛋白原降解试验观察rNaKuI10对纤溶酶纤溶活性的抑制作用.结果 成功构建了重组质粒pET32a-sumo/NaKuI10, 表达产物纯化后获得可溶性rNaKuI10.2倍及等摩尔比的rNaKuI10分别能抑制100％及90.4％的人纤溶酶活性, 22.4％及10.3％的人胰蛋白酶活性.但1、2、5倍摩尔比的rNaKuI10对人中性粒细胞弹性蛋白酶, 组织蛋白酶G, 蛋白酶3, 胰糜蛋白酶, 胰弹性蛋白酶, 凝血酶, 凝血因子Xa (FXa) 、FXIa、FXIIa、FIXa, 活化蛋白C, 血浆激肽释放酶及FVIIa/TF均无明显抑制作用.rNaKuI10对人纤溶酶的抑制常数 (ki) 为 (0.83±0.10) nmol/L.2 000nmol/L的rNaKuI10接近完全抑制1 000nmol/L的人纤溶酶对纤维蛋白平板中纤维蛋白的溶解作用, 等摩尔比的rNaKuI10可完全抑制人纤溶酶对纤维蛋白原的降解作用.结论 NaKuI10是一种抑制活性强且特异性较好的纤溶酶抑制剂, 其生物学功能还需进一步研究.

目的 探讨金水六君煎及其拆方对A549细胞黏液高分泌模型黏蛋白MUC5AC、MUC5B表达的影响.方法 制备金水六君煎及其拆方、生理盐水大鼠血清,将人肺腺癌细胞A549分为空白对照组、模型组、金水六君煎组、养阴组、化痰组.采用人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)25 nmol/L诱导A549细胞黏液高分泌,20％空白大鼠血清及含药血清进行干预.CCK8法测定细胞活性,实时荧光定量PCR法(rt-PCR)检测细胞MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表达,Western blotting检测细胞MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表达.结果 各组细胞活性无明显差异.与空白组比较,模型组细胞黏蛋白MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA与蛋白表达明显增多(P＜ 0.05或P＜0.01).与模型组比较,金水六君煎组及养阴组MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表达明显降低(P＜0.05);金水六君煎组及化痰组MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表达明显降低(P＜0.01).结论 人中性粒细胞弹性蛋白酶可诱导A549细胞粘蛋白高表达,成功建立黏液高分泌细胞模型.金水六君煎及其拆方含药血清可明显抑制黏蛋白MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA与蛋白表达.

目的 制备重组美洲钩虫Ascris型蛋白酶抑制剂1(rNaTIL-1),并观察其抗凝血活性及抑制丝氨酸蛋白酶作用.方法 从美洲钩虫成虫cDNA中扩增获得NaTIL-1编码基因,连接入原核表达质粒pET32a-sumo后转入到大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,重组产物经Ni-NTA亲和层析纯化,纯化柱上用SUMO蛋白酶切割融合伴侣后获得rNaTIL-1.用凝血时间法检测rNaTIL-1的抗凝活性,用发色底物法检测rNaTIL-1对丝氨酸蛋白酶的抑制作用.结果 成功构建了原核表达质粒pET32a-sumo/NaTIL-1,在E.coli BL21(DE3)中表达产物大部分可溶,并纯化获得了 rNaTIL-1.rNaTIL-1对血浆凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间均无明显影响.在100倍摩尔比的过量浓度下,rNaTIL-1对人胰凝乳蛋白酶、糜酶、纤溶酶、血浆激肽释放酶和猪胰蛋白酶、胰弹性蛋白酶均无明显抑制作用,但能抑制(91.6±0.9)％的人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)活性.rNaTIL-1抑制HNE的IC50值约为(325.50±1.05)nmol/L,Ki值约为(0.34±0.04)μmol/L.结论 NaTIL-1无抗凝血活性,但具有较强的抑制HNE活性,可能在美洲钩虫参与调控宿主炎症反应和逃避宿主免疫中发挥作用.

目的 富集枇杷Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.叶活性五环三萜组分并进行含量测定.方法 明确枇杷叶中主要的五环三萜单体的抑制人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)活性,在此基础上,富集高HNE抑制活性的五环三萜组分,测定其含量并进行方法学验证.结果 经HNE抑制活性测试,枇杷叶主要的五环三萜组分中蔷薇酸无显著HNE抑制活性,山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸均显示出较好的HNE抑制活性,IC50在13.30～31.29μmol/L范围内.通过提取纯化,从枇杷叶提取物中富集得到以山楂酸、科罗索酸、齐墩果酸、熊果酸为主的总五环三萜酸组分,其中4种活性五环三萜含量达74％以上,形成的提取物IC50为4.412μg/mL,按照分子量为500计,相当于8.824μmol/L,优于三萜酸单体.结论 用于富集纯化枇杷叶中4种活性五环三萜组分的方法可行,五环三萜的含量测定方法稳定、可靠.

为探讨异丙酚在脓毒症诱导的急性肺损伤(acute lung injury,ALI)小鼠模型中的保护作用并通过体外试验观察其对甲酰基肽受体1(formyl peptide receptor 1,FPR1)激动剂诱导的人中性粒细胞活化的抑制作用,将40只小鼠随机分为4组,每组10只:1组为用50μL 10％二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)处理的假手术小鼠;2组为用50 μL异丙酚(40 mg/kg)处理的假手术小鼠;3组为用50μL 10％ DMSO处理的脓毒症小鼠(该模型通过单次腹腔注射200 μL LPS构建);4组为用50 μL异丙酚(40 mg/kg)处理的脓毒症小鼠.采用免疫组织化学法检测各组小鼠肺组织中FPR1、淋巴细胞抗原6G(lymphocyte antigen 6 complex locus G,Ly6G)表达;髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)测定试剂盒评估肺组织中MPO活性;ELISA检测试剂盒评估支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中主要炎性因子水平.此外,体外条件下于培养的人中性粒细胞中分别添加DMSO或异丙酚,采用分光光度法检测中性粒细胞释放弹性蛋白酶和超氧化物的情况;Western blotting检测促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路蛋白的表达情况.结果 显示,脓毒症显著增加了小鼠肺部组织FPR1和Ly6G蛋白表达水平及MPO活性(均P＜0.01),而经腹腔异丙酚注射可有效减少FPR1和Ly6G蛋白表达并显著抑制MPO活性(P＜0.01).与假手术组相比,脓毒症小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL1表达水平显著增加(均P＜0.01),而异丙酚腹腔注射显著逆转了上述变化(均P＜0.05).体外试验结果显示,异丙酚(5～ 100 μmol/L)剂量依赖性地显著减少了N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine,fMLF)诱导的中性粒细胞弹性蛋白酶和超氧化物释放(均P＜0.05).Western blotting分析显示,异丙酚显著降低了fMLF诱导的人中性粒细胞细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)、p38 MAPK和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)的磷酸化水平(均P＜0.001).由此,在脓毒症诱导的小鼠ALI模型中,异丙酚腹腔注射可显著改善其肺部损伤,下调FPR1和Ly6G表达及肺组织中中性粒细胞数.进一步体外试验证实,异丙酚对fMLF诱导的中性粒细胞活化的抑制作用是通过与FPR1结合介导的,可抑制FPR1下游信号转导和炎症级联反应.

目的 探讨Exocyst复合物关键亚基Sec3蛋白在气道黏液高分泌形成过程中的作用.方法 将60只大鼠随机分成3组:正常对照组,烟雾暴露组、烟雾暴露+人中性粒细胞弹性蛋白酶(HNE)组.烟雾暴露组大鼠采用烟雾暴露法建立慢性支气管炎症病理性改变,HNE攻击形成气道黏液高分泌大鼠模型.取肺组织支气管上皮,观察气道上皮杯状细胞的增生及黏液分泌情况,测定Sec3和气道黏蛋白5AC(MUC5AC)表达.HNE处理人支气管上皮细胞(16HBE),分析HNE对16HBE的Sec3、p-Sec3和MUC5AC蛋白表达的影响.sh-Sec3转染HNE处理的16HBE,分析转染效率,以及Sec3对HNE诱导的16HBE中MUC5AC分泌情况的影响.免疫共沉淀鉴定Sec3与MUC5AC的相互作用.结果 与正常对照组比较,烟雾暴露组和烟雾暴露+HNE组大鼠气道上皮杯状细胞增生及黏液分泌量增加,Sec3和M UC5AC蛋白表达水平升高,且烟雾暴露+HNE组变化更明显(P<0.05);与16HBE组比较,16HBE+HNE组的Sec3、p-Sec3和MUC5AC蛋白相对表达水平升高(P<0.05),且呈时间依赖性;与16HBE+HNE组和空质粒转染组比较,sh-Sec3组Sec3蛋白和mRNA及MUC5AC蛋白相对表达水平降低(P<0.05);Sec3蛋白可被MUC5AC抗体共沉淀,MUC5AC蛋白亦可被Sec3抗体共沉淀,且在HNE刺激下,这种相互作用可加强.结论 Sec3参与气道黏液高分泌过程,且与MUC5AC在体内外环境中均具有相互作用,介导了HNE诱导的M UC5AC高分泌.

人中性粒细胞弹性蛋白酶(human neutrophil elastase,hNE)是一种丝氨酸蛋白水解酶,主要分布于中性粒细胞中.当体内抗hNE蛋白与hNE的平衡被打破,过量释放的hNE会导致相关疾病的发生,因此抑制hNE是一种很有前途的疾病治疗策略.本文简要介绍了hNE的结构、作用机制、生理功能及hNE抑制剂的研发现状,以期能为相关研究提供参考.