目的:制备靶向CD30单克隆抗体(简称单抗) 64Cu-1，4，7-三氮杂环壬烷-1，4，7-三乙酸(NOTA)-CD30，无创性可视化评价淋巴瘤CD30的表达。 方法:通过Western blot评价5种淋巴瘤细胞株(Karpas299、Raji、Daudi、Ramos和U266)中CD30的表达水平。选择高和低表达CD30的细胞株行流式细胞术评估抗CD30单抗特异性结合能力。取NSG小鼠13只构建CD30阳性和阴性皮下荷瘤鼠模型。标记获得 64Cu-NOTA-CD30，以 64Cu-NOTA-免疫球蛋白(Ig)G为对照探针。经尾静脉注射2种探针后2、24和48 h行microPET显像及生物分布分析。采用重复测量方差分析及Bonferroni法进行数据比较。 结果:Karpas299细胞呈CD30高表达，Raji细胞呈CD30低表达。流式细胞术示抗CD30单抗与Karpas299细胞特异性结合。 64Cu-NOTA-CD30与 64Cu-NOTA-IgG的放化纯均>95%。在microPET显像中，Karpas299肿瘤 64Cu-NOTA-CD30摄取随时间延长逐渐升高，2、24和48 h分别为(11.46±0.58)、(17.60±1.16)与(19.46±0.99)每克组织百分注射剂量率(%ID/g)；48 h时与本底对比度良好，肿瘤与心(血液)比值为2.20±0.22。48 h时， 64Cu-NOTA-CD30在Karpas299肿瘤的摄取高于其在Raji肿瘤[(6.10±1.03) %ID/g]及 64Cu-NOTA-IgG在Karpas299肿瘤的摄取[(5.12±0.89) %ID/g]，差异均有统计学意义( F＝290.99， t值：19.65和22.25，均 P<0.001)。 64Cu-NOTA-CD30与 64Cu-NOTA-IgG在各组心、肝的摄取随时间延长逐渐降低。48 h体外生物分布结果与活体microPET显像基本一致。 结论:64Cu-NOTA-CD30能在活体水平无创性可视化评价淋巴瘤CD30的表达及分布情况，有望应用于靶向CD30免疫治疗的受益群体筛选及疗效评价。

目的:设计和构建表达PD-1 shRNA的靶向CD19 CAR-T细胞并验证其体外肿瘤细胞杀伤能力.方法:设计并构建表达PD-1 shRNA的CD19 CAR分子基因,将其包装成逆转录病毒载体,通过qPCR法检测病毒载体拷贝数.将慢病毒转导人原代T细胞,获得三种CAR-T细胞,分别为RNAU6-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞.采用qPCR法检测三种CAR-T细胞中PD-1 mRNA的表达水平,流式细胞术检测三种CAR-T细胞中PD-1表达水平,萤光素酶报告基因实验、流式细胞术检测在不同效靶比时CAR-T细胞对CD19阳性靶细胞(人淋巴瘤daudi细胞)的杀伤功能.结果:RNAU6-CD19 CAR、PD-1 shRNA1-CD19 CAR、PD-1 shRNA2-CD19 CAR三种CAR分子成功包装成逆转录病毒载体,病毒载体拷贝数均高于1×107拷贝/mL,转导人原代T细胞获得CAR-T细胞,RNAU6-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞转导效率分别为43.1%、55.1%、41.7%.与RNAU6-CD19 CAR-T细胞相比,PD-1 shRNA1-CD19 CAR-T、PD-1 shRNA2-CD19 CAR-T细胞中PD-1 mRNA表达水平均显著降低(均P<0.01)、细胞表面PD-1表达水平更低(均P<0.01)、体外对daudi细胞的杀伤率更高(P<0.05或P<0.01).结论:成功构建表达PD-1 shRNA的靶向CD19 CAR-T细胞,其对CD19阳性靶细胞的杀伤率显著提高,PD-1 mRNA及其翻译产物PD-1的表达减少,CAR-T细胞的耗竭减缓.

目的 探讨TCF3通过linc00152调控Daudi和Raji细胞增殖和凋亡中的功能和机制.方法 采用实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测linc00152的干扰效率;利用CCK8、Western blotting和流式细胞术检测linc00152对Daudi和Raji细胞增殖和凋亡的影响;ChIP-PCR检测TCF3与linc00152的启动子区结合;qPCR和Western blot-ting 检测TCF3的干扰效率;qPCR检测TCF3对linc00152表达水平的影响.结果 在Daudi和Raji细胞中siRNA能成功干扰linc00152的表达;CCK8结果显示,干扰linc00152能抑制Daudi和Raji细胞增殖,Western blotting和流式结果显示干扰 linc00152 能促进细胞凋亡(Daudi:35.30±2.84 vs.6.95±0.82;Raji:33.17±2.18 vs.6.47± 0.38);ChIP-PCR结果显示,TCF3能与linc00152的启动子结合;qPCR和Western blotting结果显示,TCF3的mRNA和蛋白水平均能被siRNA成功干扰;在Daudi和Raji细胞中,si-TCF3能降低linc00152的表达量(Daudi:0.509±0.048 vs.0.906±0.146;Raji:0.502±0.052 vs.0.966±0.103).结论 linc00152 能促进 Daudi 和 Raji 细胞增殖,抑制细胞凋亡,可能与TCF3对linc00152的调控有关.

目的 制备和筛选抑制伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)的抗EBV潜伏膜蛋白1(latent membrane protein-1,LMP1)单克隆抗体.方法 人工合成EBV潜伏膜蛋白 1 的跨膜结构域 5(transmem-brane domain 5,TMD5),并以此为抗原,采用杂交瘤法制备抗TMD5 单抗.ELISA法测定小鼠腹水中的抗体效价.7-氨基放线菌素D(7-Aminoactinomycin D,7-AAD)/Annexin V-PE双标记流式细胞术和JC-1 染色联合流式细胞术测定线粒体膜电势评估单抗对 BL细胞系 Daudi细胞的促凋亡活性.蛋白质印迹法测定Daudi细胞内促存活信号通路p38-MAPK/IKK/NF-κB相关蛋白的表达水平.结果 经过2 轮筛选,获得R2-2-5E-6C和R2-2-8D-3A两种单抗,这2 种单抗均能与TMD5 发生抗体-抗原特异性结合,而与GAPDH无免疫反应.与NC组相比,R2-2-5E-6C组和R2-2-8D-3A组处理后的Daudi细胞中Annexin V+ 7-AAD+细胞所占百分比增加;JC-1 荧光强度<104的细胞所占百分比增加;胞内p38-MAPK、IKK和NF-κB的表达水平降低(P<0.05).结论 筛选获得的抗TMD5 单抗R2-2-5E-6C和R2-2-8D-3A可通过抑制LMP1 介导的p38-MAPK/IKK/NF-κB信号通路的活性促进BL凋亡.

[目的]探讨青藤碱(SIN)对Burkkit淋巴瘤Daudi细胞增殖及α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)表达的影响.[方法]采用CCK-8法观察Daudi细胞的生长特点.分别以青藤碱及对照药物烟碱(Nic)、甲氨喋呤(MTX)干预48 h后,采用CCK-8法检测各组Daudi细胞增殖情况,采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率,采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测Daudi细胞α7nAChR蛋白表达,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测α7nAChR mRNA表达.[结果]与空白对照组比较,青藤碱抑制Daudi细胞增殖,增加细胞早期凋亡率;Nic促进Daudi细胞增殖,降低凋亡率;MTX抑制Daudi细胞增殖,增加凋亡率.Western blot和RT-PCR检测发现青藤碱降低Daudi细胞α7nAChR蛋白和mRNA表达,Nic增加Daudi细胞α7nAChR蛋白和mRNA表达,MTX对Daudi细胞中α7nAChR蛋白和mRNA表达没有明显影响.[结论]青藤碱对Burkkit淋巴瘤Daudi细胞增殖具有抑制作用并抑制α7nAChR表达,与MTX抗淋巴瘤细胞增殖的机制不同.

目的 分析microRNA-138(miR-138)靶向调节小谷氨酰胺三角四肽重复区蛋白α(SGTA)对非霍奇金淋巴瘤(NHL)细胞黏附介导的耐药(cell adhesion-mediated drug resistance,CAM-DR)的影响.方法 以HS-5细胞或纤连蛋白(FN)构建NHL细胞黏附模型;Western blotting与RQ-PCR分析miR-138对SGTA蛋白及mRNA表达的影响;双荧光素酶报告基因活性检测分析miR-138对SGTAmRNA 3'UTR活性的影响;分别用miR-138下调慢病毒载体(Lv-shmiR-138)、miR-138过表达慢病毒载体(Lv-miR-138)、对照慢病毒载体(Lv-Ctrl)感染Daudi及OCI-Ly8细胞,分析miR-138对细胞周期、黏附能力及CAM-DR的影响;收集35例弥漫大B细胞淋巴瘤患者的石蜡组织标本,分析miR-138的表达情况及其与疾病进展和耐药关系.结果 ①NHL细胞与FN或HS-5细胞黏附培养后miR-138表达水平显著高于悬浮培养组(P值均＜ 0.05).②下调miR-138的表达可增强SGTA蛋白的表达水平(P值均＜ 0.05),而对SGTA mRNA的表达水平无显著影响(P值均＞0.05).③转染野生型SGTA3'UTR载体时,过表达miR-138可显著抑制荧光素酶报告基因活性(0.73±0.03对1.00±0.02,t=0.914,P=0.002);而转染结合位点突变的突变型载体时,过表达miR-138不能显著改变报告基因活性(0.93±0.04对1.00±0.02,t=1.375,P=0.241).④在悬浮及黏附培养状态下,过表达miR-138可显著诱导Daudi及OCI-Ly8细胞G1期停滞(P值均＜0.05).⑤下调miR-138的表达对Daudi及OCI-Ly8细胞的黏附能力均无显著影响(P值均＞ 0.05).⑥在悬浮培养状态下调miR-138的表达时,多柔比星诱导细胞死亡的比例显著下降,而在黏附培养状态下调miR-138的表达,多柔比星诱导细胞死亡的比例显著上升(P值均＜ 0.05).⑦miR-138在进展及稳定患者中的表达水平显著高于完全缓解以及部分缓解患者,差异具有统计学意义(9.72±1.11对3.06土0.22,t=9.144,P＜0.001).结论 在黏附微环境中miR-138可通过靶向抑制SGTA诱导细胞周期G1期停滞促进CAM-DR进程.

目的 研究磁感应热疗联合利妥昔单抗对人淋巴瘤Daudi细胞的作用.方法 研究磁性介质与人淋巴瘤Daudi细胞的生物相容性,并对磁性介质的升温性能进行检测.将对数生长期的Daudi细胞分为对照组(只含等量溶媒)、磁感应组(加入磁性介质)、利妥昔单抗组(100μg/ml利妥昔单抗)和联合组(加入磁性介质和100μg/ml利妥昔单抗).采用CCK-8法检测各组Daudi细胞的增殖抑制率,采用流式细胞术检测各组Daudi细胞的凋亡及细胞周期情况.结果 本实验过程中选用的空心不锈钢球,生物细胞相容性和发热效率良好,Daudi细胞的毒性等级为0或1级;与磁感应组、利妥昔单抗组相比,联合组Daudi细胞的增殖抑制率增高(P﹤0.05),凋亡率明显增高(P﹤0.01),S期细胞所占比例明显增多(P﹤0.01),G0/G1和G2/M期细胞所占比例明显减少(P﹤0.01).结论 磁感应热疗磁性介质应用于淋巴瘤治疗在细胞水平是可行的;磁感应热疗单独使用可抑制Daudi细胞的增殖,诱导细胞凋亡,改变细胞周期,利妥昔单抗注射液与磁感应热疗联合应用时能够明显增强这种效应.

研究了长春新碱（VCR）和甲基泼尼龙（MP）两药单用和联合应用对3种细胞系（Nalm-6、Daudi和K562)的体外净化作用。利用多药效应分析方法定量分析了两药联合应用的效应关系。结果：两药以不同浓度比例联合应用对杀伤Nalm-6、Daudi细胞系克隆有协同作用，对前者杀伤作用最强。在达到同样杀伤效力时VCR和MP两药联用剂量分别仅为单用时的8.7%~32.3%和4.1%~29.5%。两药联用杀伤Nalm-6和Daudi细胞系克隆近零时，CFU-GM仍保留17.5±3.5%。提示：两药联用对急性淋巴细胞白血病细胞系和淋巴瘤细胞系细胞净化效果显著，为ALL患者自体骨髓移植（ABMT)用VCR和MP体外骨髓净化提供了实验依据。

目的:研究极低频磁场辐照与肿瘤发生的关系及其潜在的作用机制。方法:应用Northern及dot印迹法检测人恶性淋巴瘤Daudi细胞受不同强度的50 Hz磁场辐照和（或）促癌剂——佛波酯（TPA）的作用后其原癌基因c-fos的转录水平。结果:0.8 mT及0.4 mT 50 Hz磁场和TPA处理的c-fos基因转录水平分别是单独TPA处理的143.4%及160.7%（P <0.05）。然而，0.2 mT及0.1 mT磁场则未发现有协同TPA对c-fos基因的诱导作用（P>0.05）。单独该磁场亦无影响c-fos基因转录的作用（P>0.05）。结论:0.8 mT及0.4 mT 50 Hz磁场对TPA诱导的c-fos基因转录具有协同促进效应。

B细胞淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤,是由分化过程中淋巴细胞恶性转化的复杂过程引起的.B细胞淋巴瘤细胞的耐药性是制约B细胞淋巴瘤治疗的关键因素.自噬是细胞成分降解和再循环的重要细胞生物学过程,近年来其与肿瘤耐药性的相关性受到越来越多的关注.S100A8是钙结合蛋白S100家族的重要成员,其在淋巴瘤的的耐药调控中发挥重要作用,但具体机制尚不清楚.在该研究中,以人Burkitt淋巴瘤细胞Daudi、人B淋巴瘤细胞SUDHL-4和人套细胞淋巴瘤细胞JeKo-1为研究对象,揭示了B细胞淋巴瘤细胞的耐药性与S100A8的表达水平密切相关,且S100A8可以显著激活淋巴瘤细胞的自噬进程.慢病毒感染稳定敲低S100A8的表达后,一方面,淋巴瘤细胞内质网和线粒体内的BNIP3蛋白的表达水平显著降低,自噬受到抑制;另一方面,自噬起始复合物BECN1-PI3KC3的表达显著降低,而BCL2与BECN1的结合显著增多,进而抑制细胞自噬.