目的:构建共培养模型模拟乳腺癌的体内微环境，探讨微小RNA(miR)-19a-3p调控核因子-κB(NF-κB)通路介导乳腺癌细胞微环境影响肺血管内皮细胞表型的机制。方法:细胞计数试剂盒(CCK-8)检测筛选吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)(NF-κB信号通路的抑制剂)干预4T1细胞最佳浓度，构建4T1小鼠乳腺癌肺高转移细胞和小鼠肺微血管内皮细胞共培养模型，构建并转染miR-19a-3p mimics、NC，将细胞分为对照组、模型组、mimics-NC组、mimics组、mimics-NC+PDTC组、mimics+PDTC组，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组4T1细胞的miR-19a、NF-κB p65基因水平的表达，蛋白质印迹法(Western blot)法检测各组4T1细胞NF-κB p65及磷酸化蛋白水平的表达，CCK-8法检测各组MPVECs增殖能力，流式细胞术检测各组MPVECs凋亡，免疫荧光检测各组MPVECs中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达。两组间比较采用非配对 t检验，组间比较采用单因素方差分析。 结果:PDTC最佳作用浓度为80 mol/L，模型组细胞增殖活力高于对照组(1.67±0.02比1.26±0.04， F＝268.8， P<0.01)，凋亡率和miR-19a-3p mRNA表达低于对照组[(4.96±0.03)%比(12.26±0.05)%，mRNA相对值：0.22±0.02比1.00±0.05， F＝141.3、392.6， P<0.01]，NF-κB p65的mRNA和蛋白表达高于对照组(mRNA相对值：3.80±0.07比1.00±0.04，灰度值比值：0.69±0.05比0.13±0.02， F＝221.6、206.3， P<0.01)，VEGF蛋白表达高于对照组(平均吸光度值：0.44±0.03比0.13±0.01， F＝108.5， P<0.01)。miR-19a-3p mimic组细胞增殖能力低于模型组(1.60±0.04比1.67±0.02， F＝268.8， P<0.01)，凋亡率和miR-19a-3p mRNA表达高于模型组[(6.36±0.08)%比(4.96±0.03)%，mRNA相对值：0.60±0.03比0.33±0.01， F＝141.3、392.6， P<0.05]，NF-κB p65的mRNA和蛋白表达低于模型组(mRNA相对值：1.59±0.02比3.80±0.07，灰度值比值：0.50±0.02比0.69±0.05， F＝221.6、206.3， P<0.01)，VEGF蛋白表达高于模型组(平均吸光度值：0.24±0.02比0.44±0.03， F＝108.5， P<0.01)。 结论:miR-19a-3p调控NF-κB通路，抑制NF-κB p65蛋白磷酸化，从而介导乳腺癌细胞微环境抑制血管内皮细胞生长。

目的:通过体外间接共培养的方式，分析兔膝关节软骨单位对体外软骨细胞增殖、凋亡的影响。方法:2个月龄新西兰兔6只，购自山西医科大学动物中心。双侧股骨全层软骨组织依次酶解消化获取软骨细胞，联合酶解搅拌消化获取软骨单位。按2×10 5个/孔浓度接种于Transwell双层细胞培养板。实验组：软骨单位接种于上室，软骨细胞接种于下室；对照组：下室接种软骨细胞，上室未接种。分别在第2、4、6、8天提取各组Transwell下室软骨细胞，通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色荧光显微镜观察及磷脂结合蛋白V(Annexin V)和7-氨基-放线菌素D(7-AAD)标记流式细胞仪分析软骨细胞早期凋亡率。通过5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色荧光显微镜观察及增殖细胞核抗原(PCNA)标记流式细胞仪分析软骨细胞增殖率检测。两组间比较用 t检验。 结果:流式细胞仪分析发现，第6天实验组软骨细胞早期凋亡率为(13.60±4.65)%，明显低于对照组[(24.76±2.69)%， t＝8.271， P<0.01]；第8天实验组早期凋亡率明显低于对照组[(28.75±4.26)%比(42.48±6.06)%， t＝7.419， P<0.01]。EdU染色荧光显微镜检测发现，第6天实验组软骨细胞增殖率为(46.23±6.17)%明显高于对照组[(32.23±5.40)%， t＝3.254， P<0.05]。PCNA标记流式细胞仪检测发现，第6天实验组软骨细胞增殖率为(76.60±5.85)%明显高于对照组[(62.73±6.69)%， t＝5.573， P<0.01]；第8天实验组增殖率为(64.65±8.44)%明显高于对照组[(44.35±7.97)%， t＝7.722， P<0.01]。 结论:软骨单位延缓了间接共培养后期软骨细的早期凋亡，促进软骨细胞的增殖。

目的 探讨Toll样受体(TLR)3和4信号通路激活的间充质干细胞外泌体(MSCs-Exo)对巨噬细胞极化的影响.方法 差速贴壁法体外培养大鼠骨髓源MSCs,用外泌体提取试剂盒分别提取MSCs、TLR3信号通路激活的MSCs、TLR4信号通路激活的MSCs培养上清中的外泌体.用含10％FBS、10％L929条件培养基的RPMI-1640培养得M0型巨噬细胞,实验分6组:对照组及MSCs-Exo、TLR3信号通路激活的MSCs-Exo、TLR4信号通路激活的MSCs-Exo、LPS、IL-4+IL-13分别与M0型巨噬细胞共培养,48 h后收集各组巨噬细胞光镜下观察形态,流式和qPCR检测免疫表型(CD206、Arg-1、TNF-α、iNOS)及炎症因子(CCL22、IL-1β、IL-6、IL-10)表达的改变.组间比较采用单因素方差分析及独立t检验进行统计学分析.结果 MSCs鉴定符合间充质干细胞特性,MSCs-Exo为双层膜囊泡结构,直径在40 ～ 200mm之间,表达外泌体标志性蛋白CD9、HSP70;光镜下观察各组巨噬细胞形态,加MSCs-Exo及TLR3和TLR4信号通路激活的MSCs-Exo刺激的巨噬细胞呈长梭形,伪足较多;流式检测发现,加MSCs-Exo及TLR3和TLR4信号通路激活的MSCs-Exo刺激的巨噬细胞均高表达CD206(107.2±6.87、102.4±9.83、112.0±9.24 vs 56.0±7.38,F=47.234,P均＜0.001)、Arg-1(135.2±6.87、130.2±7.59、203.4±9.07 vs 117.8±9.12,F=109.827,P=0.009、0.048、0.000);低表达TNF-α (27.0±5.65、24.6±5.02、25.6±4.15 vs 36.6±7.09,F=4.882,P=0.046、0.015、0.017),而MSCs-Exo刺激的巨噬细胞低表达iNOS (240.2±8.43 vs 308.8±9.88,P＜0.001);TLR3和TLR4信号通路激活的MSCs-Exo刺激的巨噬细胞iNOS表达差异无统计学意义(P＞0.05).qPCR检测发现,加MSCs-Exo及TLR3和TLR4信号通路激活的MSCs-Exo刺激的巨噬细胞均高表达CCL22 (2.277±0.744、1.570±0.209、1.642±0.443 vs 1.000±0.111,F=23.654,P=0.015、0.003、0.031)、IL-10 (1.233±0.136、2.426±0.343、1.390±0.155 vs 1.000±0.130,F=103.251,P=0.048、0.000、0.008),低表达IL-1β (0.383±0.035、0.640±0.143、0.242±0.073vs 1.000±0.082,F=12.315,P=0.000、0.005、0.000)、IL-6 (0.386±0.066、0.655±0.046、0.533±0.090 vs 1.000±0.204,F=30.140,P=0.001、0.006、0.016).结论 TLR3和TLR4信号通路激活的MSCs-Exo均能促使巨噬细胞向M2型极化.

目的:探讨大鼠髓核细胞来源外泌体对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的作用.方法:采用贴壁法体外分离培养SD大鼠尾椎椎间盘髓核细胞和BMSCs,流式细胞术和三系分化实验鉴定BM-SCs.差速离心法分离髓核细胞外泌体,透射电镜观察其形态并使用蛋白免疫印迹(Western blot)检测其蛋白标志物CD81、Tsg101.分别使用荧光探针CM-DIO和CM-DIL标记BMSCs和髓核细胞外泌体,将两者共培养24h后在荧光显微镜下观察BMSCs对髓核细胞外泌体摄取情况.将第三代BMSCs分为三组:外泌体组,加入髓核细胞外泌体(50μg/ml);共培养组,与髓核细胞非接触式共培养;对照组,未做任何处理.分别于7、14、21d时应用荧光定量PCR (qRT-PCR)检测外泌体组和对照组Ⅱ型胶原(COL2A1)、蛋白多糖(ACAN)、SOX9的mRNA表达量.14d时应用qRT-PCR检测3组的COL2A1、ACAN、SOX9的mRNA表达量.结果:提取的第三代大鼠髓核细胞呈多角形或不规则形状,第三代BMSCs呈形态均一的长梭形.BMSCs高表达CD29 (99.77％)、CD44(93.97％)、CD90(99.67％),低表达CD34(0.82％)、CD45 (0.68％).BMSCs成骨、成脂、成软骨诱导后染色均为阳性.透射电镜观察外泌体为30～100nm类圆形双层膜结构,其表达CD81、Tsg101蛋白,不表达Calnexin蛋白.荧光显微镜下CM-DIL标记的外泌体可被CM-DIO标记的BMSCs摄取.诱导7、14、21d后,外泌体组的COL2A1、ACAN、SOX9 mRNA表达量均显著高于对照组(P＜0.05).14d时共培养组COL2A1、ACAN、SOX9的mRNA表达量均显著高于对照组,低于外泌体组(P＜0.05).结论:大鼠髓核细胞外泌体可在体外诱导BMSCs向髓核样细胞分化,且诱导效果优于与髓核细胞的非接触式共培养,可为椎间盘组织工程提供一种有效的髓核细胞来源.

目的:应用双层软光刻技术和微流控芯片技术,制备以星形胶质细胞为桥梁,神经元-星形胶质细胞-脑微血管内皮细胞在同一立体空间或平面内肩并肩生长的微流控芯片.方法:(1)设计一种贯通三通道神经血管单元的体外共培养微流控芯片模型.(2)基于双层光刻技术制备芯片模板及神经血管单元共培养微流控芯片.(3)测算不同通道进样流速比.(4)在芯片内培养神经血管单元3种要素细胞.结果:(1)芯片内3个主流道的长度均为1 cm,高度均为45μm,中间主流道的宽度为570μm,两侧主流道的宽度均为500μm.设计流道间孔径的长度均为30μm,宽度和高度均为10μm,孔径的间距均为15μm.(2)甩两层光刻胶,第1层结构高度为10μm、第2层结构高度为35～40μm、总高度约为45μm的芯片模板进行后续试验.(3)A、B、C三通道进样流速比为5:6:5.(4)明场下神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞在微流控芯片内以星形胶质细胞为桥梁背靠背生长.结论:本研究设计一种神经血管单元三细胞共培养微流控芯片,使3种要素细胞以星形胶质细胞为桥梁在同一平面肩并肩生长,能更好地模拟体内细胞所处的微环境,有助于细胞间相互作用、信号传导和信息交流的研究.

为了更好地模拟体内肿瘤组织复杂的微环境特点,本研究采用间接共培养的方法,构建了乳腺癌细胞(human breast adenocarcinoma cells,MCF-7)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的体外共培养模型,以用于后续抗血管生成和诱导肿瘤凋亡的双重疗法的体外研究.分别以同期单独培养的MCF-7和HUVECs细胞为对照,对共培养的MCF-7和HUVECs细胞在培养过程中的细胞活性、形态、电阻、周期和血管内皮生长因子(VEGF)含量进行了考察.结果显示,与单独培养的MCF-7和HUVECs细胞相比,共培养的两种细胞活性更高,且发生了变形、结构变疏松的形貌改变,表现出更低的电阻值,细胞周期活跃、增殖明显(S和G2/M期比例较大),以及有更高的VEGF表达(约1.4～2倍).该模型很好地模拟了体内肿瘤细胞与肿瘤血管的相互作用关系,可作为设计肿瘤靶向释药系统的体外研究模型.

目的 探讨装载阿苯达唑的细胞外囊泡体外对细粒棘球蚴原头节活性的影响.方法 将H22小鼠肝癌细胞分为低、中、高浓度组,分别加入终浓度为200、400、600μmol/L的阿苯达唑,紫外线(UVB,300 J/m2)照射1h,孵育18～20h,然后通过超高速差速离心法制备阿苯达唑载药囊泡;以同样方法制备未加阿苯达唑的空载囊泡.用透射电镜观察载药囊泡的形态、激光粒度仪测量粒径、液相色谱仪检测载药囊泡的最佳载药量.将体外培养的细粒棘球蚴原头节随机分为4组,分别加入培养基(空白对照组)、空载囊泡(空载囊泡组)、载药囊泡(载药囊泡组)、阿苯达唑(阿苯达唑阳性对照组),其中载药囊泡组和阿苯达唑阳性对照组的阿苯达唑终浓度为13μmol/L.共培养第1、3、5、7天取原头节进行伊红染色,观察原头节形态与活力,计算各组的存活率;共培养第3、5、7天取原头节,用半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)检测试剂盒检测原头节caspase-3的表达量,观察原头节凋亡情况.组间比较使用单因素方差分析.结果 透射电镜观察结果显示,载药囊泡形态呈大小不一的小囊泡,具有双层膜结构;粒径为200～400 nm.液相色谱检测结果显示,低、中、高浓度组载药囊泡的阿苯达唑有效药物浓度分别为(36.3±2.85)、(79.0±2.30)、(99.5±4.20)μmol/L.有效药物浓度的的提高幅度,中浓度组较低浓度组高于高浓度组较中浓度组,差异有统计学意义(F=21.43,P＜0.05),制备载药囊泡的最适加药浓度为400μmol/L.伊红染色后镜下观察结果显示,共培养第7天,空白对照组及空载囊泡组的原头节活性良好,形态、结构清晰;阿苯达唑阳性对照组原头节活性减弱,结构欠清晰,体积缩小;载药囊泡组原头节结构紊乱、皱缩、死亡;共培养第7天,空白对照组、空载囊泡组、阿苯达唑阳性对照组、载药囊泡组原头节存活率分别为(91.2±1.07)％、(88.9±1.43)％、(64.5±1.19)％、(45.3±0.98)％,载药囊泡组原头节存活率均低于其他各组,差异有统计学意义(F=1021.17,P＜0.05).原头节凋亡检测结果显示,共培养第3天,空白对照组、空载囊泡组、阿苯达唑阳性对照组和载药囊泡组caspase-3的表达量分别为(41.80±3.02)、(40.26±2.78)、(55.20±3.09)和(68.15±3.60)μmol/L;第 5 天分别为(43.18±2.43)、(43.02±3.13)、(52.17±4.13)和(62.74±3.16)μmol/L,第 7 天分别为(52.93±1.46)、(53.08±1.60)、(57.32±1.81)和(61.99±1.14)μmol//L;第 3、5、7天,各组间差异均有统计学意义(F=51.97、24.53、23.82,P＜0.05),载药囊泡组caspase-3的表达量均高于阿苯达唑阳性对照组(F=22.36、12.43、14.33,P＜0.05).结论 载药囊泡可提高阿苯达唑的溶解度,增强阿苯达唑对细粒棘球蚴原头节的杀伤效果.

目的:利用自蒸发与冷冻干燥相结合技术,构建壳聚糖-藻酸钙-锂皂石纳米片止血复合膜(止血复合膜),体外检测促凝血效果及细胞毒性,体内验证止血效果与黏膜黏附效果,探讨其作为新型口腔止血膜的可行性.方法:分层构建双层结构止血复合膜,利用自蒸发法制备下层壳聚糖部分,结合冷冻干燥技术制备上层藻酸钙-锂皂石纳米片海绵部分.采用扫描电镜与透射电镜观察复合膜的微观结构,X射线衍射分析其成分.使用凝血板法分析止血复合膜组、医用纱布组、海壳生?复合膜组以及空白对照组的体外凝血时间.培养NIH/3T3细胞,与止血复合膜浸提液(实验组)、壳聚糖-藻酸钙浸提液(阴性对照组)及细胞培养基(空白对照组)共培养24、48 h,以CCK-8法检测细胞增殖情况.构建比格犬口腔颊黏膜创面与下颌前磨牙拔牙创模型,体内验证凝血复合膜的止血性能及口腔黏膜黏附效果.采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析.结果:止血复合膜呈双层结构,上层为包含锂皂石纳米片的海绵样结构,下层为均质壳聚糖膜,X射线衍射分析证实锂皂石纳米片的存在.体外凝血实验中,止血复合膜组的体外凝血时间的细胞增殖差异无统计学意义(P>0.05).动物实验证实,止血复合膜具有良好的黏膜黏附性及止血效果.结论:制备的止血复合膜具有较好的止血作用,无明显细胞毒性,具有作为口腔止血膜的潜能.间显著低于医用纱布组、海壳生组?及空白对照组(P<0.001).CCK-8检测显示,实验组、阴性对照组及空白对照组之