目的:探究甲氨蝶呤载药囊泡对小鼠实验性牙周炎的治疗作用。方法:分离人脐带间充质干细胞（hUC-MSC）的细胞外囊泡（EVs）。构建甲氨蝶呤（MTX）载药囊泡（MTX-EVs）并通过扫描电镜及动态光散射仪（DLS）对构建的载药囊泡进行形态大小分析，通过蛋白质印迹法对其表面特异性蛋白进行鉴定。选取4~5周C57BL/6J雄性小鼠40只，通过盲抓法随机抽取其中8只不做处理，正常饲养作为对照组（由第四军医大学实验动物中心提供），其余小鼠利用脂多糖（LPS）（2 g/L，5 μl）牙周局部注射诱导小鼠牙周炎模型，间隔1天注射1次，诱导2周。将成功诱导牙周炎模型小鼠通过盲抓法随机分为4组，每组8只。分别为LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组。牙周局部治疗2周后，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测牙龈组织炎症因子白细胞介素（IL）-1β、IL-6及肿瘤坏死因子α（TNF-α）的质量浓度。通过显微CT（micro-CT）、HE染色评估对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组小鼠的牙槽骨吸收情况。流式细胞仪分析牙龈组织中γ干扰素（IFN-γ）阳性细胞的占比。结果:扫描电镜结果显示EVs和MTX-EVs呈圆形或椭圆形，DLS粒径分析证明EVs粒径在200 nm左右，MTX-EVs粒径在300 nm左右。ELISA结果显示，对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度分别为（28.86±2.76）、（51.50±2.04）、（35.26±2.40）、（45.49±2.04）、（35.77±3.49）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度均显著低于LPS组（均 P<0.05）；LPS+MTX-EVs组IL-1β质量浓度显著低于LPS+EVs组（ P<0.05）。对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度分别为（125.44±4.12）、（221.64±10.59）、（178.16±16.90）、（181.09±18.22）、（170.15±9.04）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度均显著低于LPS组（均 P<0.05）；LPS+MTX-EVs组IL-6质量浓度显著低于LPS+EVs组和LPS+MTX组（均 P<0.05）。对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度分别为（320.27±38.68）、（479.62±40.94）、（342.18±25.89）、（415.88±12.01）、（325.75±30.83）ng/L；LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度均显著低于LPS组（均 P<0.05）；LPS+MTX-EVs组TNF-α质量浓度显著低于LPS+EVs组及LPS+MTX组（均 P<0.05）。micro-CT扫描结果显示，对照组、LPS组、LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组小鼠右上颌第一磨牙第一牙根处釉质牙骨质界到牙槽嵴顶的距离分别为（0.11±0.03）、（0.28±0.02）、（0.23±0.03）、（0.20±0.04）、（0.18±0.03）mm，与LPS组相比，LPS+MTX组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组骨吸收均得到不同程度的抑制，差异均有统计学意义（均 P<0.05），其中LPS+MTX-EVs组与LPS+MTX组及LPS+EVs组相比，骨吸收抑制效果最好，且差异均有统计学意义（均 P<0.05）。流式细胞仪检测结果显示，LPS组、LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组IFN-γ阳性细胞占比分别为（11.77±1.02）%、（6.87±0.65）%及（4.15±0.92）%，LPS+EVs组及LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比均显著低于LPS组（均 P<0.05），LPS+MTX-EVs组中IFN-γ阳性细胞占比显著低于LPS+EVs组（ P<0.05）。 结论:MTX-EVs可有效改善牙周炎模型小鼠牙周局部炎症环境，减少小鼠牙槽骨骨吸收。

目的:探讨肿瘤细胞来源的细胞外囊泡装载阿霉素对人肝癌细胞PLC/PRF/5增殖及凋亡的影响。方法:以"直接共同孵育"合成装载阿霉素的细胞外囊泡，即载药囊泡，运用透射电镜观察形态，动态光散射仪测定粒径，蛋白免疫印迹技术鉴定CD 63、HSP 70及TSG 101的表达，液相-质谱联用仪计算载药率，体外药物释放实验模拟体内载药囊泡的药物缓释，采用PKH67染色观察细胞对载药囊泡的摄取，采用MTS实验和流式细胞术检测载药囊泡对人肝癌细胞PLC/PRF/5增殖及凋亡影响。结果:载药囊泡在透射电镜下呈大小不一的椭圆样双层膜结构；动态光散射仪观察直径为(115.9±5.2)nm；蛋白免疫印迹检测表达CD 63、HSP 70及TSG 101；载药囊泡包封率为0.77%；体外释放实验显示载药囊泡能缓慢释放药物；PKH67示踪实验显示16小时内肝癌细胞能够摄取载药囊泡；MTS实验结果显示，经载药囊泡处理72小时后，肝癌细胞PLC/PRF/5的活性为(54.9±3.2)%，显著低于阿霉素组的(77.7±5.4)%，差异有统计学意义( P<0.05)；细胞凋亡检测结果显示，载药囊泡组处理48小时后细胞凋亡率为(47.9±7.0)%，高于阿霉素组的(38.0±1.5)%，差异有统计学意义( P<0.05)。 结论:载药囊泡能够抑制肝癌细胞增殖并促进其凋亡。

随着精准医疗的快速发展,细胞外囊泡在肿瘤等疾病的诊断和转化应用中展现出巨大潜力."载药囊泡化肿瘤靶向治疗术"是中国原创的新型肿瘤免疫治疗技术,其以肿瘤细胞来源的微囊泡作为载体,包裹或负载临床常用小分子化疗药物,通过药物靶向递送、趋化和激活中性粒细胞、逆转巨噬细胞极化表型及促进肿瘤抗原提呈等多重作用机制实现对肿瘤细胞的有效杀伤.历经十余年的抗肿瘤机制探究、临床前评估及临床试验,该技术已成功完成临床转化,获批临床应用.为进一步推动"载药囊泡化肿瘤靶向治疗术"在临床的规范和科学应用,中国免疫学会肿瘤免疫与生物治疗专业委员会和中国抗癌协会肿瘤生物治疗专业委员会联合组织细胞外囊泡及肿瘤免疫治疗领域的技术和临床专家,经过多次商讨与修订,最终撰写了《"载药囊泡化肿瘤靶向治疗术"临床应用专家共识》.本共识就"载药囊泡化肿瘤靶向治疗术"在肿瘤治疗领域的研究和应用进行了介绍,并对该技术面临的挑战及未来发展方向进行了展望,旨在为其临床合理使用提供建议及参考.

目的 分离葡萄不同组分并重组构建功能囊泡,考察其装载多肽类药物的性能.方法 采用乙醇为溶剂提取葡萄多酚(GP),通过单因素和正交试验优化GP的提取工艺.大孔树脂吸附法纯化GP.正交试验考察蜂毒肽(Mel)与GP的复合条件,制备纳米复合物(GPMC).蔗糖密度梯度离心法提取葡萄囊泡(GDVs),用于装载优化的GPMC,得到GPMC-GDVs.考察GPMC-GDVs在PBS、DMEM、10％ FBS中的稳定性.MTT法评价其对SMMC-7721及HepG2细胞的毒性.结果 优化的GP提取工艺:60％乙醇为提取溶剂,料液比1∶10,提取温度50℃,提取50 min,提取2次.GP纯化条件:4 mg/mLGP粗提物上样7 BV(树脂床体积),水洗5 BV,60％乙醇洗脱5 BV.GPMC-GDVs制备工艺:室温下,将0.4 mg/mL GDVs缓慢滴入等体积含Mel质量浓度为2 mg/mL的GPMC溶液中,孵育30 min.制备的GPMC-GDVs在PBS、DMEM、10％ FBS中稳定性良好.MTT结果显示,GPMC-GDVs具有明显的肿瘤抑制作用.结论 通过对GP与GDVs组分的分离重组,可制备含药囊泡,并能用于活性多肽的装载,在多肽类药物递送和抗肿瘤领域具有较好的应用前景.

目的:制备脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNPs),对其载不同性质蛋白及体外释药行为、储存稳定性和热稳定性进行研究,探索其用作蛋白药物载体的可行性.方法:分别以生理条件下带负电荷的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和带正电荷的胰蛋白酶(trypsin,Try)为模型药物,采用一步溶解法制得载药囊泡BSA-LNPs和Try-LNPs,并计算其包封率和载药量,利用透射电镜观察载药囊泡形貌,利用粒度仪测定粒径及Zeta电位,通过酶活性、粒径/Zeta电位的变化评价载蛋白囊泡的储存稳定性和热稳定性,采用透析法进行体外释药实验.结果:LNPs能高效负载BSA和Try,其包封率分别为93.6％和59.05％,载药量分别为48.42％和37.13％,载药后粒径分别为132.3和124.0 nm,Zeta电位分别为8.62和11.31 mV.LNPs释放Try的速率较BSA更快.同等处理条件下,Try-LNPs中Try的残余酶活性较游离Try高.Try-LNPs冻干粉于4和-20℃储存1年其酶活性、粒径/Zeta电位均基本不变;Try-LNPs和游离Try的PBS溶液于4℃保存4周,Try-LNPs粒径/Zeta电位基本不变,且残余酶活性较游离Try高.结论:LNPs能高效负载并缓释生理条件下带正/负电荷的蛋白,且基本不影响蛋白活性,具有临床应用潜力.

囊泡,也称为微颗粒,是细胞活化或凋亡过程中由细胞膜包裹细胞内容物以“出芽”方式释放到细胞外的囊泡状结构,其直径为100～1000nm,肿瘤细胞来源的载药囊泡是将肿瘤细胞来源的囊泡经过特殊处理,使其能够与常规化疗药物有机结合,形成以囊泡为载体的载药微颗粒.载药囊泡细胞亲和力高、生物相容性高、靶向性和特异性高、免疫原性低,能够将药物有效传递到靶细胞,逆转肿瘤干细胞耐药性,重塑免疫微环境,在肿瘤免疫治疗中有广泛的应用前景.本文就目前肿瘤细胞来源的载药囊泡的研究进展进行综述.

恶性胸腔积液(MPE)常继发于恶性肿瘤,无论原发部位如何,MPE的出现均提示疾病进展及预后不良.顽固性胸腔积液患者需要反复进行胸腔穿刺,穿刺术可能会导致循环功能障碍,增加患者入院频率,影响生活质量.MPE的治疗尚停留在姑息性治疗阶段,如何有效地将药物输送到靶细胞和组织是治疗的关键之处.目前,多项关于MPE治疗方式的研究正在进展中.本综述旨在总结MPE引流和局部治疗的研究进展,以期为MPE临床工作的开展提供新思路,从而在延长患者生存期的同时提高其生活质量.

目的 探讨细胞外囊泡(EVs)装载多柔比星对人膀胱癌BIU-87细胞增殖及凋亡的影响.方法 体外培养BIU-87细胞并进行EVs提取,制备装载多柔比星的载药囊泡.实验分为空白对照组(不进行处理)、EVs组(EVs混悬液,100个/细胞)、多柔比星组(0.3μg多柔比星)、载药囊泡组(载药囊泡混悬液,100个/细胞).采用MTT法和流式细胞法分别检测细胞增殖率和凋亡率,实时荧光聚合酶链式反应(RT-PCR)法和Western blot法分别检测细胞中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)、β-连环蛋白(β-catenin)、Notch1的mRNA及蛋白表达水平.结果 EVs组和载药囊泡组细胞内PKH67标记的团块状绿色荧光均匀;与空白对照组比较,EVs组上述指标均无显著差异(P>0.05);与空白对照组及EVs组比较,多柔比星组和载药囊泡组细胞增殖率、β-catenin和Notch1 mRNA及蛋白表达水平均显著降低,细胞凋亡率、GSK-3βmRNA及蛋白表达水平均显著升高,且载药囊泡组更优(P<0.05).结论 EVs装载多柔比星抑制BIU-87细胞增殖和促进其凋亡的作用较单用多柔比星强,机制可能与抑制β-catenin/Notch1信号通路有关.

目的 探讨装载阿苯达唑的细胞外囊泡体外对细粒棘球蚴原头节活性的影响.方法 将H22小鼠肝癌细胞分为低、中、高浓度组,分别加入终浓度为200、400、600μmol/L的阿苯达唑,紫外线(UVB,300 J/m2)照射1h,孵育18～20h,然后通过超高速差速离心法制备阿苯达唑载药囊泡;以同样方法制备未加阿苯达唑的空载囊泡.用透射电镜观察载药囊泡的形态、激光粒度仪测量粒径、液相色谱仪检测载药囊泡的最佳载药量.将体外培养的细粒棘球蚴原头节随机分为4组,分别加入培养基(空白对照组)、空载囊泡(空载囊泡组)、载药囊泡(载药囊泡组)、阿苯达唑(阿苯达唑阳性对照组),其中载药囊泡组和阿苯达唑阳性对照组的阿苯达唑终浓度为13μmol/L.共培养第1、3、5、7天取原头节进行伊红染色,观察原头节形态与活力,计算各组的存活率;共培养第3、5、7天取原头节,用半胱天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)检测试剂盒检测原头节caspase-3的表达量,观察原头节凋亡情况.组间比较使用单因素方差分析.结果 透射电镜观察结果显示,载药囊泡形态呈大小不一的小囊泡,具有双层膜结构;粒径为200～400 nm.液相色谱检测结果显示,低、中、高浓度组载药囊泡的阿苯达唑有效药物浓度分别为(36.3±2.85)、(79.0±2.30)、(99.5±4.20)μmol/L.有效药物浓度的的提高幅度,中浓度组较低浓度组高于高浓度组较中浓度组,差异有统计学意义(F=21.43,P＜0.05),制备载药囊泡的最适加药浓度为400μmol/L.伊红染色后镜下观察结果显示,共培养第7天,空白对照组及空载囊泡组的原头节活性良好,形态、结构清晰;阿苯达唑阳性对照组原头节活性减弱,结构欠清晰,体积缩小;载药囊泡组原头节结构紊乱、皱缩、死亡;共培养第7天,空白对照组、空载囊泡组、阿苯达唑阳性对照组、载药囊泡组原头节存活率分别为(91.2±1.07)％、(88.9±1.43)％、(64.5±1.19)％、(45.3±0.98)％,载药囊泡组原头节存活率均低于其他各组,差异有统计学意义(F=1021.17,P＜0.05).原头节凋亡检测结果显示,共培养第3天,空白对照组、空载囊泡组、阿苯达唑阳性对照组和载药囊泡组caspase-3的表达量分别为(41.80±3.02)、(40.26±2.78)、(55.20±3.09)和(68.15±3.60)μmol/L;第 5 天分别为(43.18±2.43)、(43.02±3.13)、(52.17±4.13)和(62.74±3.16)μmol/L,第 7 天分别为(52.93±1.46)、(53.08±1.60)、(57.32±1.81)和(61.99±1.14)μmol//L;第 3、5、7天,各组间差异均有统计学意义(F=51.97、24.53、23.82,P＜0.05),载药囊泡组caspase-3的表达量均高于阿苯达唑阳性对照组(F=22.36、12.43、14.33,P＜0.05).结论 载药囊泡可提高阿苯达唑的溶解度,增强阿苯达唑对细粒棘球蚴原头节的杀伤效果.

目的:探讨载 5-氟尿嘧啶细胞囊泡对结直肠癌细胞株 HCT116 的杀伤作用.方法:设HCT116组、细胞囊泡组(Evs混悬液5mL、106 个/mL)、5-氟尿嘧啶组(5-氟尿嘧啶 5mL、30μg/mL)、5-氟尿嘧啶载药囊泡组(Evs混悬液5mL、106 个/mL+5-氟尿嘧啶 5mL、30μg/mL),以上各组细胞每孔设6 个平行样,培养72h.培养结束后,测定细胞增殖侵袭、凋亡水平,RT-PCR 法及蛋白印迹法测定各组细胞miR-128、PIK3 水平.结果:细胞囊泡组OD值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数、迁移距离、凋亡率、miR-128 水平、PI3K mRNA和蛋白水平与HCT116 组比较无统计学差异(P＞0.05);5-氟尿嘧啶组、5-氟尿嘧啶载药囊泡组OD值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数、迁移距离、PI3KmRNA 和蛋白水平明显低于HCT116 组、细胞囊泡组(P＜0.05),凋亡率、miR-128 水平明显高于HCT116 组、细胞囊泡组(P＜0.05);5-氟尿嘧啶载药囊泡组OD值、存活率、单克隆形成数目、穿膜数、迁移距离、PI3K mRNA和蛋白水平明显低于5-氟尿嘧啶组,凋亡率、miR-128 水平明显高于 5-氟尿嘧啶组(P＜0.05).结论:细胞外囊泡装载5-氟尿嘧啶能明显抑制结直肠癌细胞株HCT116 增殖、侵袭水平,增强其凋亡水平,其机制可能与细胞外囊泡装载5-氟尿嘧啶能促进结直肠癌细胞株HCT116 高表达miR-128,低表达PI3K有关.