目的:构建共培养模型模拟乳腺癌的体内微环境，探讨微小RNA(miR)-19a-3p调控核因子-κB(NF-κB)通路介导乳腺癌细胞微环境影响肺血管内皮细胞表型的机制。方法:细胞计数试剂盒(CCK-8)检测筛选吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)(NF-κB信号通路的抑制剂)干预4T1细胞最佳浓度，构建4T1小鼠乳腺癌肺高转移细胞和小鼠肺微血管内皮细胞共培养模型，构建并转染miR-19a-3p mimics、NC，将细胞分为对照组、模型组、mimics-NC组、mimics组、mimics-NC+PDTC组、mimics+PDTC组，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组4T1细胞的miR-19a、NF-κB p65基因水平的表达，蛋白质印迹法(Western blot)法检测各组4T1细胞NF-κB p65及磷酸化蛋白水平的表达，CCK-8法检测各组MPVECs增殖能力，流式细胞术检测各组MPVECs凋亡，免疫荧光检测各组MPVECs中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达。两组间比较采用非配对 t检验，组间比较采用单因素方差分析。 结果:PDTC最佳作用浓度为80 mol/L，模型组细胞增殖活力高于对照组(1.67±0.02比1.26±0.04， F＝268.8， P<0.01)，凋亡率和miR-19a-3p mRNA表达低于对照组[(4.96±0.03)%比(12.26±0.05)%，mRNA相对值：0.22±0.02比1.00±0.05， F＝141.3、392.6， P<0.01]，NF-κB p65的mRNA和蛋白表达高于对照组(mRNA相对值：3.80±0.07比1.00±0.04，灰度值比值：0.69±0.05比0.13±0.02， F＝221.6、206.3， P<0.01)，VEGF蛋白表达高于对照组(平均吸光度值：0.44±0.03比0.13±0.01， F＝108.5， P<0.01)。miR-19a-3p mimic组细胞增殖能力低于模型组(1.60±0.04比1.67±0.02， F＝268.8， P<0.01)，凋亡率和miR-19a-3p mRNA表达高于模型组[(6.36±0.08)%比(4.96±0.03)%，mRNA相对值：0.60±0.03比0.33±0.01， F＝141.3、392.6， P<0.05]，NF-κB p65的mRNA和蛋白表达低于模型组(mRNA相对值：1.59±0.02比3.80±0.07，灰度值比值：0.50±0.02比0.69±0.05， F＝221.6、206.3， P<0.01)，VEGF蛋白表达高于模型组(平均吸光度值：0.24±0.02比0.44±0.03， F＝108.5， P<0.01)。 结论:miR-19a-3p调控NF-κB通路，抑制NF-κB p65蛋白磷酸化，从而介导乳腺癌细胞微环境抑制血管内皮细胞生长。

目的:观察载骨髓间充质干细胞(BMSCs)的双层胶原神经管对于修复大鼠坐骨神经离断损伤的修复效果。方法:将成年雄性SD大鼠21只，按照1∶2取3只作为空白组对照，其余18只SD大鼠随机分为3组，分别为自体组(AG组)、空管组(CT组)和细胞＋管组(C＋CT组)。通过体外分离培养Sprague-Dawley(SD)大鼠(南京医科大学动物实验中心提供)BMSCs接种双层胶原管构建神经组织工程移植物，植入大鼠坐骨神经1 cm缺损动物模型后16周，从大体观察、行为学、电生理、免疫组织化学等指标比较各组修复神经离断损伤的情况来评价修复效果，空白组切除后留出10 mm的空隙直接缝合。CT组仅用胶原管桥接神经，C ＋ CT组使用注入BMSC细胞悬液的胶原管，AG组将离断出的神经翻转180°后缝合在缺损处。应用GraphPad Prism 6统计软件分析，采用单因素方差分析。结果:术后16周大体观察发现在胶原管组(CT组)BMSCs复合胶原管组(C＋CT组)和自体组(AG组)中神经都己再生。通过坐骨神经功能指数(SFI)、复合肌肉动作电位(CMAP)值、靶肌湿重比、远端再生神经数目等定量指标分析显示，C＋CT组和AG组的修复效果均优于CT组，差异有统计学意义(SFI, CT：－92.490±1.836；C＋CT：－70.010±7.805；AG：－70.130±8.744； F＝17.850， P<0.05)，AG组虽优于C＋CT组但C＋CT组和AG组之间差异无统计学意义(湿重比，CT：0.308 7±0.146 1；C＋CT：0.455 0±0.062 9；AG：0.625 7±0.128 3； F＝9.036， P>0.05)。 结论:构建的载BMSCs双层胶原神经管在修复大鼠坐骨神经1 cm缺损中展现出与"金标准"自体神经修复接近的修复效果。

目的:改善胶束存在的水溶性药物包封率低、胶束稳定性较差以及难入胞等问题.方法:采用瞬时纳米沉淀技术以mPEG-DSPE和mPEG-PDLLA为载体材料,奥沙利铂为模型药物,制备了mPEG-DSPE&mPEG-PDLLA/OXA复合胶束,并与载药普通胶束mPEG-PDLLA/OXA和载药双层脂质杂化纳米粒LPHNP/OXA进行对比.结果:采用单因素筛选得到复合NPs的最佳制备工艺为总流速4 mL/min、流速比1∶3、总材料浓度为3.75 mg/mL、材料比为1∶2、反溶剂种类为乙腈,制得三种NPs粒径均一,包封率均大于70%;药物体外释放试验结果说明复合胶束释放速度较普通胶束慢,且相较于杂化纳米粒复合胶束能够实现药物的完全释放;摄取及凋亡实验结果说明复合胶束在三者中具有最好的摄取及药效.结论:采用瞬时纳米沉淀技术制备的复合胶束,可以显著提升对水溶性药物的包封率、提高稳定性并且在细胞层面增强摄取和药效,且该种技术作为一种简单的,便于商业化的制备方法,可为胶束的生产应用和转化提供新思路.

目的:探讨静脉注射人脐带间充质干细胞(MSCs)源性小细胞外囊泡(sEVs)对实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)小鼠的治疗作用。方法:分离并培养人脐带MSCs，收集细胞培养上清液，采用超速离心法分离MSCs源性sEVs。采用Nanosight分析sEVs粒径，透射电子显微镜下鉴定sEVs形态；采用Western blot法检测sEVs表面标志物CD9、CD81和CD63蛋白的表达。取48只SPF级7周龄C57BL/6雌性小鼠，采用光感受器间维生素A类结合蛋白651-670 (IRBP 651-670)注射法制备EAU模型。采用随机数字表法将模型小鼠随机分为sEVs治疗组和磷酸盐缓冲液(PBS)对照组，每组24只。sEVs治疗组小鼠于EAU造模后第11天尾静脉注射MSCs源性sEVs 50 μg，PBS对照组以同样方法注射同体积PBS。造模后第8天各组分别随机选取6只小鼠扩瞳后检眼镜下观察眼底炎症情况，隔日1次，并进行炎症评分。造模后第18天采用颈椎脱臼法各组处死6只小鼠，立即摘取双眼眼球制作眼球石蜡切片并行苏木精-伊红染色，进行眼底病理炎症评分。各组分别随机选取6只小鼠，于造模后第18天颈椎脱臼法处死，立即摘取双眼眼球，采用流式细胞术检测小鼠眼球组织中辅助性T细胞1 (Th1细胞)、Th17细胞浸润情况；于造模后第14天各组分别颈椎脱臼法处死6只小鼠，立即分离脾脏及引流淋巴结中的T细胞，采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)法检测终质量浓度为0、1、10和20 μg/ml IRBP 651-670条件下T细胞增生情况。另选取3只正常小鼠，采用磁珠阴选法分离脾脏初始T细胞，分为sEVs处理组和PBS对照组，根据分组加入10 μg/ml的MSCs源性sEVs或等体积PBS进行共孵育，分别在Th1/Th17细胞分化条件下培养，采用流式细胞术检测各组初始T细胞向Th1/Th17细胞分化情况。 结果:分离的人脐带MSCs源性sEVs直径平均为(102.4±33.6) nm，透射电子显微镜下sEVs呈双层膜囊泡结构，sEVs中CD9、CD63和CD81蛋白呈高表达。造模后14、16、18、20和22 d，sEVs治疗组眼底炎症评分均低于PBS对照组，差异均有统计学意义(均 P<0.05)。造模后18 d，sEVs治疗组小鼠眼球组织病理评分明显低于PBS对照组，差异有统计学意义( P<0.05)。造模后18 d，sEVs治疗组小鼠眼球组织中Th1、Th17细胞百分比分别为(15.55±2.03)%和(15.67±2.15)%，明显低于PBS对照组的(21.35±0.72)%和(20.90±1.10)%，差异均有统计学意义( t＝6.58、5.31，均 P<0.01)。在IRBP 651-670质量浓度为20 μg/ml条件下，sEVs治疗组T细胞体外增生能力显著低于PBS对照组，差异有统计学意义( P<0.05)。sEVs处理组初始T细胞分化为Th1细胞和Th17细胞的百分比分别为(28.15±1.32)%和(11.60±2.23)%，明显低于PBS对照组的(31.58±1.75)%和(23.52±1.76)%，差异均有统计学意义( t＝3.93、10.26，均 P<0.05)。 结论:尾静脉注射人脐带MSCs源性sEVs可明显减轻EAU小鼠眼底炎性反应，其机制与抑制初始T细胞向Th1和Th17细胞的分化，减少眼球中Th1和Th17细胞浸润有关。

目的:探讨体外培养构筑卡波西样血管内皮瘤(KHE)血管生成三维模型的效果及可行性。方法:选择2019年4月在河南省人民医院血管瘤科接受手术治疗的1例4个月龄男性KHE患儿，将术中切除的瘤体组织作为实验样本。将处理后的瘤体新鲜标本种植于双层夹心法构筑的纤维凝胶培养体系中，完成KHE血管生成三维模型的建立。潮湿恒温孵育，隔日换液，每日观察生长情况。待模型生长稳定后，取生长情况较好的模型制成冰冻切片行HE染色及免疫组织化学实验验证。结果:构筑的模型孵育2~4 d萌生出新生的血管芽，12~16 d血管生长情况趋于稳定，新生血管交错成网状，可观察到明显的管腔样结构，大部分模型于26~30 d后开始凋亡，个别模型直至孵育第54天仍未凋亡。经形态学观察、HE染色、免疫组织化学实验鉴定，证实新生的血管网由KHE血管内皮细胞组成。结论:纤维蛋白凝胶培养体系能够完成KHE三维血管生成模型的培养，具有培养时间短、存活时间长、操作简便、实验成本低、易于干涉的特点。

目的:通过构建体外氧糖剥夺/再氧合（OGD/R）模型，探讨脑缺血再灌注过程中星形胶质细胞（AS）源性外泌体对脑微血管内皮细胞损伤的保护作用及机制。方法:（1）通过双荧光素酶报告基因检测确定miR-193b-3p对抑制瞬时受体电位M2型通道（TRPM2）的调控作用。采用miR-193b-3p模拟物/阴性序列转染bEnd.3细胞后进行OGD/R造模（分别为OGD/R+miR-193b-3p模拟物组及OGD/R+miR-193b-3p阴性序列组），通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测细胞miR-193b-3p表达、Western blotting实验检测TRPM2、Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、ZO-1和Claudin-5蛋白表达，采用流式细胞术检测细胞凋亡率。（2）从C57BL/6乳鼠大脑皮层提取AS并鉴定。通过CCK-8法确定AS造模时间并通过超高速离心法提取AS培养基中的外泌体，采用电镜、粒径和标志蛋白进行鉴定，采用RT-qPCR法检测AS及其外泌体中miR-193b-3p含量。随后采用miR-193b-3p抑制序列转染AS后提取低表达miR-193b-3p的外泌体，与OGD/R造模的bEnd.3细胞共孵育（OGD/R+AS转染抑制剂外泌体组）；采用miR-193b-3p阴性序列转染AS后提取外泌体，与OGD/R造模的bEnd.3细胞共孵育（OGD/R+AS转染阴性序列外泌体组）；正常外泌体与OGD/R造模的bEnd.3细胞共孵育为OGD/R+AS外泌体组。通过RT-qPCR法检测各组细胞miR-193b-3p表达，通过Western blotting实验检测TRPM2、Cleaved-Caspase-3、Bax、Bcl-2、ZO-1和Claudin-5蛋白表达，采用流式细胞术检测凋亡率，采用划痕实验检测细胞迁移能力。结果:（1）双荧光素酶报告基因检测显示miR-193b-3p可结合 TRPM2 mRNA，且转染miR-193b-3p模拟物后TRPM2蛋白表达明显减少，与OGD/R组比较差异有统计学意义（ P<0.05）。与OGD/R组相比，OGD/R+miR-193b-3p模拟物组细胞Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2、ZO-1和Claudin-5蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（ P<0.05）。提示miR-193b-3p可改善OGD/R过程中由TRPM2介导的bEnd.3细胞凋亡和紧密连接减少。流式细胞术进一步验证了上述结论，表现为与OGD/R组（21.34%）比较，OGD/R+miR-193b-3p模拟物组细胞凋亡率（13.93%）明显下降，差异有统计学意义（ P<0.05）。（2）研究中提取的外泌体呈脂质双层杯状、粒径主要在126.5 nm左右，外泌体标志蛋白Cal为阴性、CD81和SG101为阳性，提示外泌体提取成功。造模后，AS及其外泌体中miR-193b-3p含量均降低，与Control组比较差异均有统计学意义（ P<0.05）。进一步研究发现，与OGD/R组比较，OGD/R+AS外泌体组及OGD/R+AS转染阴性序列外泌体组中miR-193b-3p表达明显升高，TRPM2、Cleaved-Caspase-3和Bax蛋白表达明显降低，ZO-1、Claudin-5和Bcl-2表达明显升高，差异有统计学意义（ P<0.05）；而OGD/R+AS转染抑制剂外泌体组细胞上述蛋白表达无明显改变，组间差异无统计学意义（ P>0.05）。流式细胞术凋亡检测结果与之一致，表现为与OGD/R组（18.22%）相比，OGD/R+AS外泌体组、OGD/R+AS转染阴性序列外泌体组细胞组细胞凋亡率（14.09%、13.79%）明显降低，差异有统计均意义（ P<0.05）；而OGD/R+AS转染抑制剂外泌体组细胞凋亡率（18.41%）无明显改变，差异无统计学意义（ P>0.05）。细胞划痕实验显示，与OGD/R组（13.55%）相比，OGD/R+AS外泌体组、OGD/R+AS转染阴性序列外泌体组细胞迁移能力（43.01%、40.59%）明显增强，差异均有统计学意义（ P<0.05）；而OGD/R+AS转染抑制剂外泌体组细胞迁移能力无明显改变（16.26%），差异无统计学意义（ P>0.05）。 结论:AS源性外泌体可通过miR-193b-3p远距离抑制脑微血管内皮细胞上的TRPM2蛋白表达，改善OGD/R造成的脑微血管内皮细胞损伤，进而改善OGD/R损伤。

目的 体外验证过表达膜定位IL-3 的 293T细胞外泌体的功能,为在阿尔茨海默病模型动物的体内功能验证奠定基础.方法 利用本课题组的专利结构,构建能定位于外泌体膜上的重组 IL-3 慢病毒载体,包装病毒感染 293T细胞,筛选稳定表达细胞株.用流式细胞测量术和免疫荧光技术对 IL-3 的膜定位进行验证;超滤离心纯化IL-3 外泌体,透射电镜观察外泌体形态;纳米流式测量术检测外泌体粒径分布及浓度;Western blot检测IL-3 及外泌体相关标志蛋白质表达;免疫荧光技术检测其对小胶质细胞系 BV-2 吞噬 Aβ淀粉样蛋白能力的影响.结果 经过载体构建、病毒感染、嘌呤霉素筛选和验证,得到稳定过表达膜定位 IL-3 的 293T细胞株;收集纯化外泌体,在透射电镜下可见直径 50～100 nm的双层膜囊泡结构;免疫印迹结果显示 CD63、ALIX、TSG101 等多种外泌体标志蛋白质检测阳性,且与对照相比富含 IL-3,提示 IL-3 外泌体纯化成功;免疫荧光技术检测结果显示IL-3 外泌体能在体外促进BV-2 细胞对 Aβ淀粉样蛋白的吞噬作用.结论 过表达膜定位IL-3 的基因修饰 293T细胞外泌体在体外兼具IL-3 和外泌体的作用,能够促进小胶质细胞的吞噬作用,为阿尔茨海默病的临床治疗提供新的思路.

目的 评价头花蓼纳米纤维功能敷料(P-PVP-PCL)的药效.方法 利用静电纺丝技术制备P-PVP-PCL,观察其微观形貌;考察P-PVP-PCL的抑菌活性、抗氧化活性和对小鼠成纤维L929细胞存活率、黏附性及迁移率的影响.通过建立大鼠背部皮肤伤口模型,考察医用纱布敷料、空白纳米纤维敷料(PVP-PCL)和P-PVP-PCL对创面愈合率的影响,观察创面组织病变和胶原纤维沉积情况,以及创面组织中血小板内皮细胞黏附分子1(CD31)阳性血管数量和转化生长因子β(TGF-β)蛋白表达.结果 制得的P-PVP-PCL表面光滑,断面处可见双层结构,对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的抑制率分别为(98.88±0.66)%、(94.75±1.41)%,抗氧化活性为(83.69±1.56)%,且P-PVP-PCL组的细胞活性均显著高于对照组和PVP-PCL组(P＜0.05).与医用纱布敷料相比,P-PVP-PCL更有利于L929细胞黏附;在48 h时,该组的细胞划痕已基本愈合.与医用纱布敷料组比较,PVP-PCL组和P-PVP-PCL组的大鼠创面愈合率均显著升高(P＜0.05).干预第14天时,P-PVP-PCL组创面已基本愈合,创面组织中胶原纤维排列相对整齐、密度相对均匀;CD31阳性血管数量和TGF-β蛋白表达与干预第7天比较有下降趋势,其中CD31阳性血管数量显著低于医用纱布敷料组和PVP-PCL组(P＜0.05),TGF-β蛋白表达显著高于医用纱布敷料组和PVP-PCL组(P＜0.05).结论 P-PVP-PCL在体外具有良好的抗菌和抗氧化活性,能够促进L929细胞的增殖、黏附和迁移;在体内能够促进大鼠伤口愈合.

目的 采用溶剂浇铸法制备口腔溃疡双层膜剂,研究青黛表面改性前后对膜剂质量与药效的影响.方法 通过单因素实验设计和响应面优化法优选膜剂最佳处方,并对膜剂表面形貌、黏附时间、抗拉强度、含量测定以及体外药物释放等性能进行评估.进一步采用化学灼烧法建立大鼠口腔溃疡模型,考察膜剂对溃疡组织肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1 β,IL-1β)、IL-6以及口腔溃疡组织形态的影响.结果 空白隔离层确定为25 mg/mL的乙基纤维素乙醇溶液,载药膜最佳处方为63 mg/mLPVA17-88、55 mg/mL PVPK30、3.0 mg/mL明胶与0.047 mL/mL甘油.青黛表面改性后,双层膜剂比未改性双层膜剂具有更加光滑均一的外观、更高的含量均匀性和有效成分靛蓝释放率.药效学结果表明,与模型组相比,阳性组与青黛改性膜剂组显著降低了溃疡组织TNF-α、IL-1β、IL-6的含量(P＜0.05),并减少了炎症细胞的浸润,溃疡组织愈合程度较高.结论 青黛改性之后的口腔溃疡双层膜剂具有更好的质量与更佳的疗效,具有较好的应用前景.

目的 探究siRNA沉默动力相关蛋白1(Drp1)后对鱼藤酮诱导的帕金森病模型细胞自噬以及细胞凋亡的影响.方法 体外培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y,用1μm、5μm、10μm、20μm鱼藤酮进行处理24 h、48 h,MTT法检测细胞抑制情况.将细胞分为鱼藤酮最佳浓度处理组(20μm鱼藤酮处理,损伤组)、阴性转染组(损伤组基础上转染Drp1阴性序列)、Drp1siRNA处理组(损伤组基础上转染Drp1 siRNA)、Drp1抑制剂组(损伤组基础上添加Mdivi-1试剂)、自噬促进剂组(损伤组基础上添加雷帕霉素).观察各组线粒体自噬情况、细胞线粒体功能相关蛋白(Mfn2、Drp1、NRF1)、自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3、P62)、凋亡蛋白(Bcl-2、Bax)表达情况和细胞凋亡情况.结果 与对照组相比,鱼藤酮处理组细胞抑制率均升高,随着浓度以及培养时间的增加,细胞抑制率逐渐增加(P<0.05).损伤组、阴性转染组、自噬促进剂组LC3II定位在细胞线粒体,且细胞线粒体结构受损,外周出现自噬双层膜.与Drp1 siRNA转染组、Drp1抑制剂组相比,损伤组、阴性转染组、自噬促进剂组Drp1、LC3II、Beclin-1、Bax蛋白表达和细胞凋亡率升高,Mfn2、NRF1、P62、Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05).结论 Drp1参与鱼藤酮诱导帕金森病细胞线粒体自噬,沉默Drp1用.可降低鱼藤酮诱导帕金森病细胞线粒体自噬以及细胞凋亡,具有保护作.