等温扩增技术是在恒温条件下进行扩增的一类新型核酸扩增技术。基于该技术建立的方法操作简便，且具有较高的灵敏度与特异性，在临床与科研等方面展现了较好的应用前景。本文就环介导等温扩增、交叉引物扩增、链替代扩增、依赖核酸序列的等温扩增和滚环扩增等技术的原理、特点及应用进行了综述。

目的:以基因组最大RNA病毒(冠状病毒)为代表，研究不同测序前样本处理模式对高通量测序获得病毒全基因组序列信息质量的影响。方法:以细胞培养的人冠状病毒HCoV-OC43样本为代表，分为4种测序前样本处理模式，即：未处理组、核酸提取前DNase和RNase处理组、核酸提取后DNase处理组、核酸提取前DNase和RNase处理且核酸提取后DNase处理组。不同模式处理后的核酸分为两份，一份直接RNA测序(未扩增)，另一份经序列非依赖的单引物扩增(SISPA)后DNA测序。结果:尽管不同处理方式下获得的病毒基因组覆盖率差别不大，但是样本核酸提取后经DNase处理组直接测序获得了最高的基因覆盖度和测序准确性，而SISPA扩增可有效提高病毒测序读长(reads)比例与基因组各位点的测序深度。结论:本研究为优化冠状病毒等RNA病毒全基因组测序策略提供了技术参考。

核酸体外扩增技术给分子生物学学科带来了革命性的变更。经过近40年的相关技术的开发和应用，核酸体外扩增技术业已成为临床病毒实验室中的主导手段。非引物依赖的宏基因扩增技术、下一代核苷酸序列测定技术等病毒核酸检测技术在临床上逐渐得到更广泛的应用。为了核酸检测技术能够有效精准用于临床，一些检测前注意事项需要关注；需要开发简单、快速、准确和安全的床边/即时(point of care)检测技术；更要注意到结果的正确解读。病毒核酸检测技术的临床合理应用必将极大推动临床病毒学的发展。

目的 为实现快速检测新型冠状病毒(SARS-CoV-2),干预和防止病毒的传播,研制一种基于双重CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2核酸胶体金快速检测试纸条.方法 通过设计基于ORF1ab和N基因靶序列内的正反两个依赖原间隔邻近基序(PAM)位点crRNAs,将恒温扩增技术与CRISPR-Cas12a检测相结合,并结合侧向层析试纸条技术,实现对SARS-CoV-2 ORF1ab和N基因同时扩增与双重CRISPR的可视化检测.结果 检测试纸条可在37 ℃条件下20 min内取得结果,具有较好的灵敏度、特异度及热稳定性.对SARS-CoV-2假病毒的检测灵敏度为250 copy/mL,检测16种其他呼吸道病原体均无交叉反应,在37 ℃条件下存放8 d仍然具有较好检测效果.临床研究显示,检测SARS-CoV-2总符合率为95.00％(57/60).结论 基于双重CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2核酸胶体金快速检测试纸条提高检测效率和准确度的同时降低了成本,可用于SARS-CoV-2的现场快速检测.

目的 通过对HIV病毒载量(VL)实验室检测方法的参比校正,分析中国MSM人群HIV感染者(MSM感染者)社区VL水平(CVL).方法 利用国家科技重大专项2014-2015年15个大城市MSM感染者VL抽样调查数据.15个大城市根据各自配置的检测设备、试剂完成VL检测.VL检测方法主要包括RT-PCR、核酸序列依赖性扩增法(NASBA)、分支DNA测定技术(bDNA)、雅培M2000(M2000)4种方法.按照国家HIV参比实验室2013-2015年VL能力验证结果,将EasyQ、bDNA和M2000这3种方法检测的VL值转换成相应的TaqMan 2.0检测的VL值,校正不同检测方法之间的参比关系.采用SPSS 17.0软件对数据进行描述性分析.结果 15个城市CVL对数均值参数校正前后,2014年分别为(2.38±1.47)、(2.99±1.31),2015年分别为(2.07±1.34)、(2.72±1.19).分别以VL水平≤200拷贝/ml、≤400拷贝/ml、≤1 000拷贝/ml作为VL成功抑制标准,对参比校正VL值前后比例进行比较发现,以VL水平≤400拷贝/ml及≤1 000拷贝/ml标准的参比校正前后数据变化幅度较小.结论 各地区保持统一的检测方法,能增加各年度间VL的可比性;以VL≤400拷贝/ml或≤1 000拷贝/ml作为人群VL成功抑制标准,进行各地区间VL比较,数据稳定性较好.

目的 分析江苏省一起胃肠炎暴发疫情中分离的诺如病毒基因特征.方法 对2016年12月16-27日江苏省一起急性胃肠炎暴发疫情中病例的肛拭子标本进行核酸提取,利用诺如病毒特异性引物对部分RNA依赖的RNA聚合酶序列及完整衣壳蛋白序列(VPl)进行RT-PCR扩增,扩增产物测序后进行基因特征分析.结果 序列比对结果显示,PCR产物在诺如病毒RNA依赖的RNA聚合酶区与GⅡ.g型别的西班牙株及芬兰株处于同一分支,同源性为98.7％,在VP1区与GⅡ.1型别的美国株同源性更高(99.4％),初步推断为重组病毒.进一步通过重组分析软件Simplot分析,其可能重组位点在VPl的5 106位点,定位在ORF1/2交叠区.VP1氨基酸变异位点分析显示,其假定的抗原表位及受体结合表位均未出现变异,仅在1 32位氨基酸位点由N突变为S.结论 江苏省胃肠炎暴发疫情中分离的诺如病毒为GⅡ.g-GⅡ.1重组变异株.

目的:建立基于核酸序列依赖扩增的酶联免疫(enzyme-linked immunosorbent assay of nucleic acid sequence-based amplification,NASBA-ELISA)法用于侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)的诊断,并评价其诊断价值.方法:将核酸序列依赖扩增技术(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)方法和高灵敏度的地高辛检测系统相结合,采用地高辛标记NASBA恒温扩增曲霉菌特异性18sRNA基因片段,用生物素标记的DNA探针在链酶亲和素包被的微孔板孔中杂交捕获地高辛标记的NASBA扩增产物,最后加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体和底物进行酶标显色,应用此法分别对梯度数量的曲霉菌孢子和其他临床常见菌株进行检测以评价其灵敏度和特异度,并通过对82例临床标本(32例阳性,50例阴性)的检测分析其临床诊断效能.结果:将含有梯度数量的曲霉菌孢子的样本提取总RNA后进行NASBA-ELISA检测,结果表明光密度值与霉菌孢子量对数存在线性相关关系(y=0.278x +0.119,R2=0.887),该方法的灵敏度可达1个孢子;对照菌株(大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌和新型隐球菌)和曲霉菌提取RNA后进行检测,结果仅曲霉菌的吸光度(absorbance,A)值大于设定的阈值(6个随机阴性标本的平均A值+3倍标准差)呈阳性;对82例临床标本进行NASBA-ELISA检测,其敏感度和特异度分别为80.6％、80.0％,受试者工作特征曲线曲线下面积为0.759(95％CI=0.644～0.874).结论:NASBA-ELISA方法检测曲霉菌具有敏感性高、特异性强、操作简便的特点,适合常规实验室开展,为侵袭性曲霉病的早期诊断提供了一条新方法.

目前,我国正处于H7N9禽流感病毒疫情高发季节.2017年春季以来,我国福建、云南、湖南和湖北等16个省份均出现了感染H7N9的病例,并且感染数量和范围与去年同期相比有明显上升和扩大.H7N9禽流感病毒因其对人类的高致死率和快速的传播速度引起了全球的广泛关注.快速、准确和高效的检测对H7N9禽流感的疫情监测和防控至关重要.为此,该文就目前应用于H7N9禽流感病毒研究中的分子生物学诊断技术(包括聚合酶链反应、基因芯片、依赖核酸序列的的扩增、高分辨率熔解曲线、液相芯片、重组酶介导的等温扩增法、高通量测序、环介导等温扩增及多重PCR-酶联免疫吸附法等)进行了综述.

目的 阐明不明原因发热(fever of unknown origin,FUO)的血液样本中用常规方法难以检测到的潜在病原.方法 利用二代测序技术序列非依赖的特性对病原核酸进行随机捕获,随后采用多重链置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)方法进行富集.在得到测序结果后,进行宏基因组数据分析,构建进化树,最终实现对未知病原的鉴定.结果 对10份不明原因发热的血液样本进行宏基因组二代测序分析时未发现引起发热的常见病原体序列,但发现了大量人细环病毒(Torque teno Virus,TTV)存在的现象.将所有相关测序读长进行组装拼接,并计算得到的一致性序列在匹配的参考序列上的基因组覆盖度.在对组装出的置信序列进行进化分析后,发现其分属于αTTV、β TTV和γ TTV三个属.结论 对本研究中发现的TTV的基因组特征、进化特征以及作为免疫水平评估的意义进行了分析.而对于本研究中只检测出三个属的TTV的现象,可能是因为TTV具有潜在的病原性以及感染性疾病所导致的宿主免疫水平低下,也有可能是由于其他非感染性病因导致的宿主免疫水平降低所导致.

目的 探讨不依赖序列的单引物扩增技术结合Ion Torrent高通量测序平台对重症肺炎患儿呼吸道肺泡灌洗液进行病毒病原体宏基因组检测的效果.方法 取临床重症肺炎患者肺泡灌洗液标本,进行病毒基因组核酸DNA/RNA的提取,随机引物扩增建库后,进行Ion Torrent高通量测序分析,测序结果 进行本地blast分析筛选病毒序列,运用MetaVir数据库进行病毒归类分析.结果一共获得591593条序列读长,病毒序列3545条,占0.6％,其中主要病毒及序列有腺病毒1760条(49.6％),淋巴囊肿疾病病毒1422条(40.1％),Taterapox病毒65条(1.8％),智利巨型病毒37条(1.0％),云杉卷蛾雕背姬蜂病毒33条(0.9％),猫白血病病毒32条(0.9％),网状内皮组织增生证病毒30条(0.8％),RD114逆转录病毒18条(0.5％);呼吸道病原体荧光定量聚合酶链反应结果为腺病毒7型,提示患者腺病毒7型感染.结论 该研究初步建立的病毒宏基因组分析技术平台可用于呼吸道相关已知和未知病毒病原体鉴定.