目的:了解多重RT-PCR方法检测13种常见呼吸道感染病原体，在老年患者呼吸系统感染病原体检测中的应用价值。方法:317例2016年6月至2017年5月在石家庄市第一医院老年科就诊的具有呼吸系统感染症状的老年患者，年龄60～98岁，采集其抽吸痰液，提取病毒DNA/RNA，利用多重RT-PCR技术扩增，通过毛细管电泳，同时检测13种呼吸道病原体；并以直接测序方法和荧光实时PCR法为标准，评价该试剂的临床性能。结果:使用直接测序和荧光实时PCR结果为参照，多重RT-PCR技术的准确性为99.93% (95% CI: 99.79%～99.98%)，阳性预测值为99.24% (95% CI: 97.78%～99.74%)，阴性预测值为100% (95% CI: 99.9%～100%)，Cohen’s kappa值为0.9958 (95% CI: 0.965 2～1.026)。在317例老年患者中，呼吸道病原阳性检出率为75.7% (240/317)，其中甲型流感病毒最高，为20.2% (64/317)，主要为H3亚型(70.3% (45/64)；其次为鼻病毒、腺病毒、肺炎支原体和乙型流感病毒，检出率分别为15.5% (49/317)、13.6% (43/317)、11.0% (35/317)和10.1% (32/317)。此外，同时检出2种以及2种以上病原体的老年患者为81例，检出率为25.6% (81/317)。 结论:多重RT-PCR方法能满足临床对呼吸道病原体检测的需求，并为老年患者呼吸系统感染的防治提供有效的临床资料。

目的:评估6种结核分枝杆菌检测方法对不典型肾结核的早期诊断价值，为临床诊断提供参考。方法:收集河北省胸科医院泌尿外科2015年10月至2020年12月诊治的不典型肾结核患者46例(结核组)、非结核肾病患者53例(对照组)，分别采用结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、结核菌素试验(PPD试验)、涂片抗酸杆菌染色镜检(AFB镜检法)、BACTEC MGIT960液体培养(简称液体培养法)、结核分枝杆菌脱氧核糖核酸实时荧光定量PCR(TB-DNA FQ-PCR)、利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术（GeneXpert MTB/RIF），以结核菌培养及病理结果为金标准，比较不同检测方法在不典型肾结核临床诊断中的价值。结果:T-SPOT.TB灵敏度(95.65%)高于PPD试验(73.91%)，差异有统计学意义(McNemar检验： P=0.002)；GeneXpert MTB/RIF的灵敏度为84.78%，高于AFB镜检法(4.35%)、液体培养法(28.26%)和TB-DNA FQ-PCR(58.70%)，差异有统计学意义(McNemar检验： P均<0.001)，GeneXpert MTB/RIF与三者的特异性无统计学差异(McNemar检验： P=1.000、0.500和0.250)。 结论:T-SPOT.TB与GeneXpert MTB/RIF在不典型肾结核的筛查和病原学诊断中有较高的灵敏度和应用价值，推荐应用。

目的:建立一种快速、灵敏、可视化的H7亚型禽流感病毒等温核酸扩增检测方法。方法:针对H7N9禽流感病毒的HA片段保守区序列设计引物、探针，优化反应温度，建立H7亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条检测技术，评价其特异性和敏感性，并与Real time PCR方法进行比较。结果:该方法检测H7亚型禽流感病毒的最低检出限为20拷贝/μL，与其他流感/禽流感病毒无交叉反应，反应可在20~50℃温度范围内进行，临床样本检测结果与Real time PCR法一致性为100.0％。结论:该检测方法具有快速、特异及灵敏的特点，为在基层和现场快速检测H7亚型禽流感病毒提供了新的方法。

虽然目前诊断新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染的金标准，即实时荧光定量PCR技术已被广泛应用于人群筛查并且检测限可低至1拷贝/μl，但最新的病毒动力学模型表明，相较于灵敏度而言，高频率检测和快速诊断才是减少病毒传播的关键。因此，研究人员正努力探索基于CRISPR-Cas技术的病毒RNA检测新策略。其中，Cas13a蛋白可与CRISPR RNA(crRNA)形成复合物并在crRNA的引导下靶向结合目的RNA序列，激活核酸酶活性，非特异地切割附近的任意单链RNA。利用这一特性，将带有荧光淬灭基团的RNA探针加入体系，可检测靶RNA序列。在此原理上，本研究开发了一种突破性方法，无需前期预扩增即可直接从鼻拭子RNA中检测SARS-CoV-2。通过设计针对病毒N基因和E基因的不同区域的多个crRNA，等浓度组合加入反应体系，使单次反应可以激活更多的Cas13a蛋白，检测灵敏度提高的同时也减少了基因突变导致检测脱靶的可能性，整个检测过程均在样品中直接进行，无需额外操作。此外，该新型检测平台还可以将反应速率和产生的荧光信号转化为病毒载量，样本定性的同时进行RNA定量。为了提高检测的简单性和便携性，本研究还设计了一个小型设备包括低成本的激光照明和光收集元件，可以通过手机摄像头读取CRISPR-Cas13a检测产生的荧光信号，灵敏度达到100拷贝/μl的同时能够在5 min内准确诊断出一组从新型冠状病毒肺炎患者样本中预提取的RNA。本研究开发的方法有可能为现场SARS-CoV-2筛查提供一种快速、准确、便携和低成本的选择。

感染性疾病是全球儿童致残和死亡的主要原因之一，早期快速精准诊断感染致病原并进行针对性治疗对患儿预后至关重要。分子生物学技术，特别是核酸检测技术的更新和进步极大推动了病原生物学精准检测的发展。核酸分子杂交技术、核酸扩增技术、基因芯片、测序技术、基于基因编辑的病原检测技术等不仅拓展了病原核酸检测的通量，还显著提高了检测灵敏性，已逐渐成为儿童感染性疾病诊断的重要检测手段。现对不同核酸分子检测技术方法、检测时间、检测效能及潜在卫生经济学效益等多方面进行评估，以期明确不同儿童感染性疾病病原检测的适宜策略，为临床医师的遴选提供参考。

目的:对一株诺如病毒分离株SD20200267进行鉴定和全基因组序列分析，了解其结构特征。方法:取患者标本进行病毒核酸的提取，对样本核酸进行扩增，将扩增产物进行测序，根据核苷酸序列进行基因分型。采用宏基因组测序技术进行全基因组测序，对测序所得的核苷酸序列进行分析。结果:获得SD20200267株病毒基因组全长，总长度为7 465个核苷酸。SD20200267株在VP1区及RdRp区分别属于GⅡ.12和GⅡ.P16基因型。SD20200267株与其他GⅡ.12[P16]型毒株核苷酸一致性在96.0%～97.3%之间，有15个氨基酸位点变异。该毒株存在重组现象，重组位点位于ORF1与ORF2重叠区域。结论:SD20200267株为GⅡ.12[P16]型毒株，ORF1与ORF2重叠区域存在重组现象。

重组酶聚合酶扩增（RPA）技术是一种新型核酸恒温扩增检测技术。该技术可以在37~42 ℃条件下实现待测靶标的快速检测。它具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测。本文从RPA技术的基础理论和实验要点出发概述了开展该项研究需要注意的要点，综述了RPA技术在医学检验领域的应用现状和相关问题，并展望了其未来发展的广泛前景。

目的:建立重组人甘露聚糖结合凝集素蛋白（M1蛋白）磁珠富集病原体结合重组酶辅助聚合酶链式反应（RAP）巢式核酸扩增技术检测血液中白色念珠菌和热带念珠菌的方法，以实现对白色念珠菌血症和热带念珠菌血症的早期诊断。方法:针对白色念珠菌和热带念珠菌的内转录间隔区的高度保守区域的设计引物探针，建立检测白色念珠菌和热带念珠菌的RAP检测方法；用梯度稀释的标准菌株核酸和临床常见的血流感染病原体核酸检验灵敏度、重复性、特异性；用模拟样本进行M1蛋白磁珠富集血浆白色念珠菌和热带念珠菌RAP和实时荧光PCR的检测，并对结果进行比较。结果:建立的双重RAP方法灵敏度为2.4~2.8拷贝/反应，重复性好，特异性高；M1蛋白磁珠富集病原体结合双重RAP方法可在4 h内完成对血浆中白色念珠菌和热带念珠菌的检测，<10 CFU/ml的病原体富集后进行RAP检测样本数较PCR检测样本数多。结论:本研究建立了检测血液中白色念珠菌和热带念珠菌的双重RAP方法，该检测方法具备准确、快速、减少污染物的优点，在念珠菌血症快速检测中具有较好的应用潜力。

目的:明确沈阳地区一起小学急性呼吸道感染疫情暴发的病原及其基因进化特征。方法:采集2020年12月末沈阳地区某小学暴发疫情中的患病学生咽拭子标本17份，采用TaqMan低密度阵列分析技术(TaqMan low-density arrays，TLDA)进行常见呼吸道病原检测，并对副流感病毒3型阳性标本采用巢式RT-PCR方法核酸扩增、序列测定和系统进化分析。结果:TLDA检测确定10份标本为副流感病毒3型核酸阳性，同时伴有条件致病菌感染，扩增HN基因获得7条完整序列。序列系统进化分析表明本研究7个毒株均处于C3a.1进化分支，其核苷酸同源性为99.9%，与原型株Wash/47885/57核苷酸同源性为94.6%，与进化距离最近的浙江株ZJ/11-s-165/KP690785/CHN/11为99.5%。结论:引起沈阳地区该起急性呼吸道感染暴发疫情的病原为副流感病毒3型，为我国东北地区首次报道，其处于C3a.1进化分支。

目的:对我国已批准上市的5种新型冠状病毒（2019-nCoV）核酸快速检测试剂进行多中心临床评价。方法:2020年11月在浙江大学医学院附属第一医院、华中科技大学同济医学院附属同济医院和中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所3家机构选取共计57份确诊2019-nCoV感染者及15份非感染者的咽拭子样本，对获批上市的5种2019-nCoV核酸快速检测试剂进行检测，分析阳性符合率、阴性符合率、总符合率，并分析阳性强度与阳性符合率的关系，检测时间和复检率情况。结果:5种试剂盒阳性符合率为92.59%（50/54）、83.64%（46/55）、98.25%（56/57）、94.44%（51/54）和98.18%（54/55）；阴性符合率为93.33%（14/15）、93.33%（14/15）、86.67%（13/15）、100%（14/14）和93.33%（14/15）；总符合率为92.75%（64/69）、85.71%（60/70）、95.83%（69/72）、94.20%（65/69）和97.14%（68/70）。5种试剂盒对强阳性和中阳性标本的检出率均为100%（90/90、84/84），对循环阈值33以上的弱阳性样本检出率为82.18%（83/101），2种试剂盒的复检率高于10%，分别为15.28%（11/72）和12.50%（9/72）。5种试剂盒从提取到扩增检测所需平均总时长在32.33~65.33 min。结论:5种2019-nCoV核酸快速检测试剂盒性能均较好，可以作为常规核酸检测的补充。