目的:构建针对大肠埃希菌的重组发光噬菌体（HT7），并评估其对大肠埃希菌的鉴定能力。方法:首先通过基因工程构建小向导RNA表达质粒pCRISPR-sg（1~10）和PFN-1000同源重组质粒菌株，并用双层平板筛选切割效率最高的小向导RNA（sgRNA）；采用同源重组与规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）系统联合介导的基因编辑技术，将Nanoluc萤光素酶基因整合入T7噬菌体10A基因下游的非编码区，并成功构建发光噬菌体HT7；通过噬菌斑实验和液体扩增实验评估HT7噬菌体与T7噬菌体生物特性差异；此外用2022年1月至2023年6月解放军总医院第一医学中心临床采集分离的51株大肠埃希菌、20株肺炎克雷伯菌、14株金黄色葡萄球菌、6株屎肠球菌、5株粪肠球菌、3株鲍曼不动杆菌和1株铜绿假单胞菌评估HT7噬菌体的检测专一性和检出限。结果:构建的10个CRISPR靶向切割系统中，sgRNA8靶标的切割效率最高，成斑效率为0.18；噬菌体经pCas9/pCRISPR/PFN-1000 3质粒系统3轮重组筛选后，PCR验证均为2 798 bp的重组噬菌体条带，说明成功构建了HT7噬菌体。重组噬菌体在裂解效率（ P<0.001）、一步生长曲线（ P=0.001）、感染复数（ P=0.031）的生物特性分析中，均有显著差异，裂解暴发点和对数生长节点均延长了10 min，最佳感染复数为0.1；临床样本测试，可识别裂解6株大肠埃希菌，其余菌株均不裂解，4.5 h内可检出低于10 CFU/ml的病原菌。 结论:成功开发了一种高效的噬菌体基因编辑系统，并成功构建发光噬菌体HT7，该噬菌体在4.5 h内能特异性检测出低于10 CFU/ml的大肠埃希菌，且对其他菌株无裂解作用，显示出良好的检测专一性和低检出限。

目的:对1个遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症患者所携带的复合杂合突变进行分子机制研究。方法:先证者因“突发晕厥并四肢抽搐一天”于2018年11月就诊于温州医科大学附属第一医院。采集先证者及其家系成员（共3代9人）外周静脉血并进行家系调查。采用发色底物法检测AT活性（AT：A），免疫比浊法检测AT抗原（AT：Ag）。对SERPINC1基因进行直接测序以确定突变位点。利用多种计算机工具预测突变的保守性和疏水性变化。构建重组质粒表达载体并瞬时转染HEK293T细胞以进行体外过表达研究。采用Western Blotting、ELISA和细胞免疫荧光实验对重组AT蛋白进行体外表征。结果:先证者为一例21岁男性。AT：A为 33%，AT：Ag同步下降，属于Ⅰ型AT缺陷症。基因分析显示先证者在第2和第5外显子分别携带c.318_319insT（p.Asn107*）杂合插入突变和c.922G>T（p.Gly308Cys）杂合错义突变。该两个突变位点在同源物种中均完全保守；疏水性分析表明，p.Gly308Cys突变可能降低氨基酸残基307-313的亲水性。体外表达显示，重组蛋白AT-G308C在转染细胞裂解液和培养上清中的含量分别降低至46.98%±2.94%和41.35%±1.48%；经蛋白酶体抑制剂（MG132）处理后，Western Blotting分析显示在细胞质中的AT-G308C蛋白量恢复到与野生型相似的水平；在细胞裂解液和培养上清中均未检测到重组蛋白AT-N107*。结论:p.Asn107*杂合插入突变和p.Gly308Cys杂合错义突变与该家系先证者AT水平降低有关。p.Asn107*杂合插入突变可能触发无义突变介导的mRNA降解，从而消除异常转录本；p.Gly308Cys杂合错义突变可能通过改变局部残基的疏水性导致AT蛋白在细胞质中发生蛋白酶体依赖性降解。

目的:探讨腺苷酸活化蛋白激酶亚基α2(protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2，Prkaa2）与核糖体蛋白S6激酶A1 （ribosomal protein S6 kinase A1，Rps6ka1）的关系及Prkaa2对转化生长因子β1 （transforming growth factor-β，TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞纤维化的影响。方法:用重组蛋白TGF-β1诱导NRK-52e细胞制备纤维化的细胞模型。采用实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）、蛋白质印迹法检测大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52e细胞（对照组）和10 ng/ml TGF-β1诱导12、24、36 h的NRK-52e细胞中Prkaa2的表达水平。于NRK-52e贴壁生长达30%时加入Prkaa2低表达慢病毒，转染72 h后收集细胞，并于Prkka2低表达慢病毒组及Prkaa2空病毒组中用qRT-PCR检测Prkaa2敲减效率。设立TGF-β1诱导、Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导3个实验组，同时以正常未作任何处理的NRK-52e细胞系为对照组。通过蛋白质印迹法检测Prkaa1、Prkaa2、α-平滑肌肌动蛋白（Alpha-smooth muscle actin，α-SMA）、E钙粘蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 （cysteinyl aspartate specific proteinase9，Caspase9）和p53基因（p53）的表达。从Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组和Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组中分别选取3个生物学重复样本，通过Affymetrix基因表达谱芯片测序结果筛选差异表达的基因。然后，在Prkaa2RNAi+TGF-β1、Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导2个实验组中验证Prkaa2、Rps6ka1的表达。结果:qRT-PCR及蛋白印迹检测结果显示，TGF-β1诱导12 h时NRK-52e细胞中Prkaa2的mRNA和蛋白的相对表达量分别为1. 368±0. 083和1. 311±0. 007，与对照组1. 000±0. 123和1. 159±0. 009相比，差异有统计学意义（ P<0. 05）。qRT-PCR实验结果显示Prkaa2空病毒组相对表达量为1. 042± 0. 302，较Prkaa2低表达慢病毒组为0. 171±0. 165 ，Prkaa2 mRNA表达下调，差异具有统计学意义（ P= 0. 023）。蛋白质印迹法检测结果显示，TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为2. 89±0. 04，较对照组3. 82±0. 03下调，差异有统计学意义（ P<0. 05）；TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1. 04±0. 04，较对照组1. 06±0. 05未见明显变化，差异无统计学意义（ P>0. 05）；TGF-β1诱导组α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为3. 60±0. 03、1. 07±0. 07、1. 81±0. 02、1. 17±0. 04、0. 62± 0. 01，均较对照组2. 95±0. 04、0. 74±0. 03、1. 00±0. 04、0. 77±0. 05、0. 37±0. 01上调，差异均有统计学意义（ P<0. 05）。Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组E-cadherin相对表达量为3. 57±0. 03，较空病毒+ TGF-β1诱导组3. 04±0. 15上调，差异有统计学意义（ P<0. 05）；Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导组Prkaa1相对表达量为1. 03±0. 05，较空病毒+TGF-β1诱导组1. 05±0. 06未见明显变化，差异无统计学意义（ P>0. 05）；Prkaa2RNAi+ TGF-β1诱导组Prkaa2、α-SMA、Vimentin和Bax、Caspase9、p53相对表达量分别为0. 54±0. 02、3. 21±0. 07、0. 44±0. 03、1. 16±0. 08、0. 94±0. 03、0. 44±0. 03，均较空病毒+TGF-β1诱导组0. 89±0. 01、3. 49±0. 06、0. 98±0. 07、1. 87±0. 02、1. 21±0. 04、0. 65± 0. 03下调，差异均有统计学意义（ P<0. 05）。Affymetrix基因表达谱芯片测序结果显示核糖体蛋白S6激酶A1(ribosomal protein S6 kinase A1，Rps6ka1）下调。蛋白质印迹法和qRT-PCR验证结果提示，Prkaa2RNAi+TGF-β1诱导组Rps6ka1表达相对表达量为0. 60±0. 02、0. 590±0. 026，较Prkaa2空病毒+TGF-β1诱导组1. 15±0. 04、1. 003±0. 080下调，差异有统计学意义（ P<0. 05）。 结论:Prkaa2与Rps6ka1存在正向调控关系，抑制Prkaa2可以改善TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞纤维化。

目的:观察分析模拟高载荷及失重环境下新西兰大白兔脊柱的影像学变化以及椎间盘内基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）与基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）含量的变化，探讨高载荷及失重环境对椎间盘的影响，为预防和延缓高载荷及失重环境下的腰椎间盘退变提供理论依据。方法:采用余数随机单盲法将120只年龄及体重均衡的新西兰大白兔随机分为对照组（30 d、60 d、90 d组）和高载荷/失重组（30 d、60 d、90 d组）共6组，每组20只。通过动物离心机模拟高载荷，尾部悬吊法模拟失重。检测实验动物各实验阶段影像学的改变以及MMP1、MMP3以及TIMP1在椎间盘内的阳性表达率，比较各时间段高载荷/失重组与对照组之间、不同高载荷/失重暴露时间组之间检测结果的统计学差异。结果:影像学观测到实验动物腰 6骶 1椎间盘T2加权像有一定降低。各高载荷/失重组MMP1、MMP3阳性率高于同时间段对照组，差异有统计学意义（ t=22.97~145.51， P值均 <0.001）；MMP1、MMP3阳性率随着暴露时间的延长而增高，不同高载荷/失重暴露时间组之间差异有统计学意义（ F=2531.10、1758.80， P值均 <0.001）。高载荷/失重组TIMP1阳性率高于同时间段对照组，差异有统计学意义（ t=29.34~65.05， P值均 <0.001）；不同高载荷/失重暴露时间组之间TIMP1阳性率差异有统计学意义（ F=462.20， P<0.001）。 结论:高载荷/失重会引起动物腰椎间盘中MMP1、MMP3以及TIMP1的含量发生改变，且TIMP1早期变化明显，后期敏感性降低。高载荷/失重可能导致椎间盘中MMP与TIMP的含量发生改变，进而引起椎间盘加速退变。

等温扩增技术是在恒温条件下进行扩增的一类新型核酸扩增技术。基于该技术建立的方法操作简便，且具有较高的灵敏度与特异性，在临床与科研等方面展现了较好的应用前景。本文就环介导等温扩增、交叉引物扩增、链替代扩增、依赖核酸序列的等温扩增和滚环扩增等技术的原理、特点及应用进行了综述。

目的:探讨伴核孔蛋白(NUP)98-DNA拓扑异构酶( TOP) 1融合基因复发/难治性急性髓细胞白血病(AML)患者的临床、实验室检查特点及诊疗策略，并进行相关文献复习。 方法:选择2022年2月15日海军军医大学附属第一医院(上海长海医院)收治的1例39岁伴 NUP98- TOP1融合基因复发/难治性AML女性患者为研究对象(患者1)。采用回顾性分析方法，对其病史、临床特征、实验室检查结果等进行分析。根据患者1的临床表现、实验室检查结果，对其进行诊断和治疗。对患者1随访时间截至2022年6月30日。本研究以"核孔蛋白98"" NUP98""t(11; 20)"" NUP98- TOP1融合基因""染色体易位""急性髓细胞白血病""AML""nucleoporin 98"" NUP98- TOP1 fusion gene""chromosome translocation""acute myeloid leukemia"为中、英文关键词，检索中国知网数据库、维普数据知识服务平台、万方数据知识服务平台和PubMed数据库中相关文献，总结伴t(11; 20)易位AML患者相关病例的诊疗。检索时间为上述数据库建库至2022年6月30日。本研究符合2013年修订的《世界医学协会赫尔辛基宣言》要求，并取得受试者知情同意。 结果:①患者1因"无明显诱因发热，伴胸闷、恶心1周"于当地医院就诊，经检查诊断为AML，因外院治疗缓解后复发，遂转入本院进一步治疗。②入院后，患者1血常规检查结果示，白细胞计数(WBC)、红细胞计数、血红蛋白(Hb)值、血小板计数分别为5.34×10 9/L、3.91×10 12/L、143 g/L和154×10 9/L。骨髓细胞形态学检查结果示未缓解。染色体核型为46，XX，t(11；20)(p15；q12)[10]/46，idem，del(9)(q12q22)[4]/46，XX[6]；荧光原位杂交(FISH)结果示， NUP98重排， NUP98- TOP1融合基因；逆转录PCR结果示， NUP98- TOP1、 TOP1- NUP98融合基因均呈阳性。③患者1被诊断为伴 NUP98- TOP1融合基因复发/难治性AML。予患者1小剂量HAG[高三尖杉酯碱1 mg/(m 2·d)，d1～7；阿糖胞苷10 mg/(m 2·d)，d1～7；重组人粒细胞集落刺激因子2 000 μg/(m 2·d)，d1～14，当中性粒细胞绝对数>5×10 9/L或者WBC>20×10 9/L时，暂停用药]方案化疗后，对其进行人类白细胞抗原(HLA)全相合异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)。移植后患者获得造血重建，未见白血病残留细胞，嵌合度为99.6%。截至随访结束，其一般状况良好。④按照本研究设定的文献检索策略，共纳入10篇文献，报道10例伴t(11；20)易位AML患者(患者2～11)，加上患者1，共计11例患者被纳入以下研究。其中，5例(患者1、3、5、6、10)伴 NUP98- TOP1融合基因，1例(患者9)伴 FLT3突变。7例(患者1～4、6、9、10)接受化疗。2例患者(患者1、2)接受allo-HSCT，其生存期长于未接受造血干细胞移植(HSCT)者。 结论:在初诊AML患者中常规检测 NUP98重排，有利于发现伴 NUP98重排患者，从而选择个体化治疗方案，allo-HSCT可改善患者预后。

目的:分析重组人干扰素联合拉米夫定对慢性乙型肝炎患者氧化应激蛋白及补体水平的影响，为临床治疗提供参考。方法:选取邯郸市传染病医院2017年1月至2019年1月期间收治的慢性乙型肝炎患者为患者进行前瞻性研究。138例患者采用随机数字法分为两组：对照组( n＝69)进行干扰素联合阿德福韦酯治疗，观察组( n＝69)进行重组人干扰素联合拉米夫定治疗。两组均治疗48周后分析两组患者的临床效果及治疗前后氧化应激蛋白及补体水平的变化。 结果:观察组患者的乙肝e抗原及乙肝病毒的脱氧核糖核酸的转阴率明显高于对照组( P<0.05)，两组患者经治疗后转氨酶ALT、AST及丙二醛(MDA)水平均明显降低( P<0.05)，而超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和补体C3和C4水平明显升高( P<0.05)。观察组患者的上述指标变化更明显( P<0.05)。 结论:重组人干扰素联合拉米夫定对慢性乙型肝炎疗效确切，且能恢复异常的氧化应激蛋白及补体水平。

目的:观察长链非编码RNA（lncRNA）SCAMP1-AS1在食管癌组织中的表达，探讨SCAMP1-AS1对食管癌细胞增殖和迁移的影响及可能的分子机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测鄂东医疗集团黄石市中心医院2017年3月至2020年8月手术切除的37例食管癌组织及癌旁组织、4种食管癌细胞（EC9706、TE-13、KYSE30、Eca109）及正常食管上皮细胞HET-1A中SCAMP1-AS1的表达水平。选择表达最低的细胞，以阴性对照慢病毒（LV-NC）感染为对照组，以携带SCAMP1-AS1序列的重组慢病毒（LV-SCAMP1-AS1）感染作为实验组。RT-qPCR检测感染后食管癌细胞中SCAMP1-AS1的表达。细胞计数试剂盒8（CCK-8）和Transwell小室法分别检测食管癌细胞的增殖能力和迁移能力。生物信息学方法预测SCAMP1-AS1的靶基因，双荧光素酶报告实验验证SCAMP1-AS1与靶基因的相互作用。RT-qPCR检测靶基因的表达，Western blotting检测细胞增殖和迁移表型蛋白的表达。结果:食管癌组织中SCAMP1-AS1的相对表达水平明显低于癌旁组织（1.26 ± 0.48比8.03 ± 1.17），差异有统计学意义（P<0.01）。食管癌细胞EC9706、TE-13、KYSE30、Eca109中SCAMP1-AS1的相对表达水平均低于正常食管上皮细胞（0.54 ± 0.05、0.14 ± 0.02、0.46 ± 0.07、0.77 ± 0.05比1.00 ± 0.06），差异有统计学意义（P<0.05），TE-13细胞中SCAMP1-AS1的表达最低（P<0.01）。与对照组比较，实验组TE-13细胞中SCAMP1-AS1的表达上调（P<0.01），细胞的增殖能力降低（P<0.01），细胞的迁移能力降低（P<0.01）。miR-483-5p是SCAMP1-AS1的直接作用靶点（P<0.01）。与对照组比较，实验组TE-13细胞中miR-483-5p的表达下调（P<0.01），细胞增殖和迁移表型蛋白表达降低。结论:lncRNA SCAMP1-AS1在食管癌中表达下调，SCAMP1-AS1可通过靶向调控miR-483-5p的表达抑制食管癌TE-13细胞的增殖能力和迁移能力，SCAMP1-AS1有望成为食管癌潜在的分子治疗靶点。

目的:对丝氨酸水解酶家族1（FSH1）蛋白在犬小孢子菌中进行亚细胞定位分析。方法:以前期构建的犬小孢子菌FSH1质粒及载体pCAMBIA-LRP-增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为模板，PCR扩增FSH1基因及EGFP基因；同时利用SnaBI/KpnI对pCAMBIA-LRP-EGFP质粒双酶切获得载体DNA，将扩增的EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得EGFP表达载体；将扩增的FSH1基因及EGFP基因克隆至酶切好的载体DNA中获得融合载体Ptrcp-FSH1-EGFP-Ttrcp。通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法，用重组质粒转化犬小孢子菌，使融合基因FSH1-EGFP在真菌通用启动子（Ptrpc）和终止子（Ttrpc）调控下在犬小孢子菌中整合型表达，利用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的细胞定位。结果:成功构建根癌农杆菌转化系统及犬小孢子菌EGFP表达载体；融合基因FSH1-EGFP在犬小孢子菌中获得整合型表达。激光共聚焦显微镜显示FSH1-EGFP融合蛋白的荧光信号呈颗粒状或团块状集中于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中。结论:FSH1-EGFP融合蛋白成功定位于犬小孢子菌的细胞质及细胞核中，为进一步明确犬小孢子菌FSH1基因的功能及致病机制奠定了基础。

目的:观察斑秃患者外周血白细胞介素35（IL-35）表达变化，评估IL-35对斑秃患者调节性T细胞（Treg）活性的调控。方法:收集2019年12月至2021年1月在山西省人民医院就诊的斑秃患者81例（斑秃组）和健康志愿者27例（对照组），分离血清和外周血单个核细胞（PBMC），酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清IL-35水平，实时荧光定量PCR法检测IL-35组成亚基EBI3和IL-12p35 mRNA表达，流式细胞仪检测CD4 +CD25 +CD127 dim/-Treg比例。使用重组人IL-35刺激纯化的Treg，ELISA检测培养上清液中穿孔素和颗粒酶B水平，实时荧光定量PCR检测EBI3、IL-12p35和免疫检查点分子程序性死亡蛋白1、黏蛋白结构域蛋白3、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4、淋巴细胞活化基因3 mRNA表达；将经IL-35刺激或未刺激的Treg与自体PBMC共培养，用细胞计数试剂盒8检测细胞增殖水平。计量资料两组之间比较采用 t检验，多组之间比较采用单因素方差分析，相关性分析采用Pearson检验；计数资料比较采用卡方检验。 结果:与对照组比较，斑秃组IL-35水平[（90.10 ± 11.98）ng/L比（100.74 ± 28.71）ng/L， t= 2.71， P= 0.008]、PBMC中EBI3 mRNA（1.06 ± 0.15比1.25 ± 0.11， t= 6.09， P < 0.001）、IL-12p35 mRNA（1.00 ± 0.15比1.38 ± 0.22， t= 10.16， P < 0.001）、Treg比例（5.91% ± 1.17%比6.85% ± 1.23%， t= 3.54， P= 0.001）均显著降低。斑秃组Treg比例与血清IL-35水平（ r= 0.25， P= 0.026）、PBMC中EBI3 mRNA（ r= 0.31， P= 0.004）、IL-12p35 mRNA水平（ r= 0.24， P= 0.032）均呈正相关。斑秃组未刺激的Treg分泌穿孔素、颗粒酶B水平以及EBI3、IL-12p35、免疫检查点分子mRNA表达均显著低于对照组Treg（ P < 0.05或0.001），抑制PBMC增殖的能力亦低于对照组（ P= 0.013）。重组人IL-35刺激后斑秃患者Treg分泌穿孔素和颗粒酶B水平与未刺激Treg相比无明显变化（ P > 0.05），但EBI3、IL-12p35、免疫检查点分子mRNA表达均显著升高（ P < 0.05或0.001），抑制PBMC增殖的能力亦增强（ P= 0.037）。 结论:斑秃患者外周血IL-35水平明显降低，与Treg功能减弱密切相关，可能参与斑秃发病。