目的:建立一种快速、灵敏、可视化的H7亚型禽流感病毒等温核酸扩增检测方法。方法:针对H7N9禽流感病毒的HA片段保守区序列设计引物、探针，优化反应温度，建立H7亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条检测技术，评价其特异性和敏感性，并与Real time PCR方法进行比较。结果:该方法检测H7亚型禽流感病毒的最低检出限为20拷贝/μL，与其他流感/禽流感病毒无交叉反应，反应可在20~50℃温度范围内进行，临床样本检测结果与Real time PCR法一致性为100.0％。结论:该检测方法具有快速、特异及灵敏的特点，为在基层和现场快速检测H7亚型禽流感病毒提供了新的方法。

文章旨在建立一种针对嗜水气单胞菌的敏感性高、特异性强的快速临床诊断方法.研究根据嗜水气单胞菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyrB)基因的保守序列,设计特异性重组酶聚合酶扩增技术(RPA)扩增引物,通过结合琼脂糖凝胶电泳(AGE)和侧流层析试纸条(LFD)的方法进行反应条件的优化、特异性及灵敏度检测.实验结果表明,所建立的嗜水气单胞菌RPA-LFD快速检测方法可在38℃最适温度下30min内无干扰地检测到嗜水气单胞菌,对嗜水气单胞菌纯培养物和基因组DNA的最小检出限为103 cfu/mL和100 pg/nL.利用建立的RPA-LFD与普通PCR同时检测杂交鲟鱼处理临床样品的结果表明,两种方法的结果一致.综上所述,通过对RPA反应条件的探索和优化,成功建立了嗜水气单胞菌快速检测方法.该方法操作简便,反应迅速,与普通PCR相比,不需要昂贵的仪器,为未来嗜水气单胞菌细菌性疾病的早期诊断提供了更有效的技术支持.

目的:建立一种基于重组酶聚合酶扩增(recombinant polymerase amplification,RPA)和侧向流动试纸条(lateral flow strips,LFS)的嗜麦芽窄食单胞菌快速可视化检测方法.方法:以嗜麦芽窄食单胞菌特异性序列(NC_010943.1)为模板,设计RPA引物.通过基础型RPA反应和琼脂糖凝胶电泳,根据候选引物对的扩增性能及引物二聚体的形成情况筛选最佳引物对.根据最佳引物对,设计探针和修饰引物.在引物和探针中引入碱基错配以消除假阳性信号,建立RPA-LFS反应体系.根据检测线的显色情况,优化RPA-LFS的最佳反应条件.使用临床常见的12种致病菌和12个临床来源的嗜麦芽窄食单胞菌检测该方法的特异性.以10倍梯度稀释的嗜麦芽窄食单胞菌基因组为模板,检测该方法的灵敏度.收集108例临床样本,将该方法与qPCR检测法和生化培养法对比,对RPA-LFS检测法进行kappa一致性检验及临床应用评价.结果:RPA-LFS检测法在37℃恒温条件下8 min即可完成扩增反应,1 min内可在LFS上观察到结果.该方法灵敏度高,最低检出限为1.107 CFU,并且与其他病原菌无交叉反应,特异性强.应用于临床样本检测时,该方法与qPCR相比,检测结果准确性一致.与生化培养方法的符合率为99.07%,kappa指数值为0.972,具有良好的一致性.结论:本研究建立了一种不依赖于精密仪器和专业技术人员的RPA-LFS检测方法,能够短时间内精准鉴定嗜麦芽窄食单胞菌.该方法的建立可为及时制定合理的抗菌治疗方案提供信息,具有较大的临床应用潜力.

目的 基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术结合侧向流动试纸条(LFD),建立可快速检测结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药的方法,并初步评价其临床应用价值.方法 采用比例法对182株结核分枝杆菌临床分离株进行利福平耐药性检测.建立RPA-LFD技术,检测182株菌株中利福平耐药决定区(RRDR)常见突变位点rpoB 531、526和516的突变情况,同时使用PCR测序进行验证.用SPSS 24.0分析,以比例法为金标准,评价RPA-LFD对利福平耐药的检测效率.结果 以比例法药敏结果为金标准,RPA-LFD检测利福平耐药的灵敏度为84.2％,特异度为100.0％,Kappa检验显示Kappa值为0.880,两种方法检测结果具有高度一致性.同样以比例法为金标准,以DNA测序结果判断利福平耐药性的灵敏度为91.2％,特异度为100.0％,Kappa值为0.935.结论 RPA-LFD技术用于结核分枝杆菌利福平耐药性的检测具有好的灵敏度、很高的特异度,且检测时间短,具有一定的临床应用价值.

目的 新型冠状病毒肺炎(COVID-19)传播迅速,对经济造成威胁.研究快速检测方法,为其检测建立新的方法储备. 方法 根据严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)核衣壳蛋白(N)基因、刺突蛋白(S)基因及开放阅读区(ORF1ab)基因保守区序列结合逆转录重组酶介导的等温扩增(RT-RAA)和荧光定量、胶体金侧向流免疫层析试纸条(LFD)建立逆转录重组酶介导的等温扩增荧光法(荧光RT-RAA法)和试纸条法(RT-RAA-LFD法)并进行优化,分别以构建的N、S、ORF1ab基因质粒为模板评估这两种方法的灵敏性和重复性;对其他冠状病毒质粒[如HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)、SARS]模板进行检测,验证这两种方法的特异性. 结果 两种检测方法均可在39℃恒温条件下12 min内完成检测.荧光RT-RAA法中,ORF1ab基因可检测至100拷贝数,N、S基因可检测至101拷贝数.RT-RAA-LFD法中,3种基因均可检测至103拷贝数.两种方法与其他类型的冠状病毒无交叉反应,具有良好的特异性. 结论 RT-RAA法和LFD法检测时间短并具有较好的特异性、灵敏性和重复性,可用于SARS-CoV-2的快速筛查、诊断和监测.

为建立一种快速、灵敏并适用于临床检测Ⅲ型鲤疱疹病毒(CyHV-3,KHV)的方法,实验根据KHV SphI-5基因的保守序列片段设计引物及探针,采用重组酶聚合酶扩增技术结合侧流层析试纸条(RPA-LFD)检测KHV.重组酶聚合酶扩增技术(RPA)具恒温扩增及高灵敏度特点,简化了设备要求的同时又能做到高效检测病毒,再结合侧向流动试纸条(LFD)将RPA结果快速地可视化,提高了该疾病的检测效率.结果表明,在38℃的最适反应温度下,采用RPA-AGE技术仅需10min便可检测出病原的目标片段,结合LFD方法仅需5min便可将RPA结果通过试纸条可视化呈现.研究研发的KHV RPA-LFD检测方法简单、快捷,可为实验条件有限的养殖场快速诊断需求提供技术支撑.