目的:探讨肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)和黏附素MrkD优势抗原表位融合蛋白对KP感染小鼠的免疫保护作用。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP ompA和mrkD序列，通过生信分析选取这两个蛋白的优势抗原表位，经融合聚合酶链反应(PCR)扩增表位序列后克隆至pColdI载体，并转入本科室保存的大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，Ni ＋层析凝胶纯化后获得重组蛋白rAD。rAD经皮下免疫22只BALB/c小鼠，同时设置22只佐剂对照组。完成免疫程序后通过酶联免疫吸附试验(ELISA)对小鼠血清中的抗体水平和脾脏体外抗原刺激后细胞因子分泌水平进行测定，并对小鼠鼻腔注射KP，观察免疫后的小鼠存活率和肺脏细菌数量。组间比较采用 t检验。 结果:分别扩增出ompA和mrkD抗原表位序列，并成功融合，融合片段大小为1 056 bp，与预测大小一致，克隆至pColdI载体后测序，测序正确。重组表达菌BL21(DE3)-pColdI-rAD经IPTG诱导后破碎收集上清纯化，获得可溶性rAD，大小为38.4×10 3，与预测大小一致。rAD 3次免疫BALB/c小鼠后，免疫组抗体滴度显著高于对照组(170 667.00±59 121.00比0.00±0.00， t＝5.00， P<0.01)。KP感染小鼠后，免疫组小鼠存活率显著高于对照组[(65.00±5.00)%比(0.00±0.00)%， t＝22.52， P<0.01]，免疫组小鼠肺脏细菌数显著低于对照组[(9 500.00±1 384.00) CFU比(87 833.00±25 365.00) CFU， t＝7.55， P<0.01]。脾细胞分离后经rAD刺激，免疫组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)分泌量均显著高于对照组[(115.70±17.21) pg/ml比(24.00±9.17) pg/ml， t＝8.14， P<0.01；(200.30±8.51) pg/ml比(9.00±3.00) pg/ml， t＝36.75， P<0.01；(92.33±6.11) pg/ml比(9.67±1.53) pg/ml， t＝22.73， P<0.01]。 结论:KP OmpA和MrkD优势抗原表位融合蛋白rAD，免疫BALB/c小鼠有助于对KP感染的抵抗。

目的:建立一种快速、灵敏、可视化的H7亚型禽流感病毒等温核酸扩增检测方法。方法:针对H7N9禽流感病毒的HA片段保守区序列设计引物、探针，优化反应温度，建立H7亚型禽流感病毒的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条检测技术，评价其特异性和敏感性，并与Real time PCR方法进行比较。结果:该方法检测H7亚型禽流感病毒的最低检出限为20拷贝/μL，与其他流感/禽流感病毒无交叉反应，反应可在20~50℃温度范围内进行，临床样本检测结果与Real time PCR法一致性为100.0％。结论:该检测方法具有快速、特异及灵敏的特点，为在基层和现场快速检测H7亚型禽流感病毒提供了新的方法。

重组酶聚合酶扩增（RPA）技术是一种新型核酸恒温扩增检测技术。该技术可以在37~42 ℃条件下实现待测靶标的快速检测。它具有反应灵敏度高、特异性强、对仪器依赖程度低且可整合多种检测模式等优点，特别适用于基层和现场即时检测。本文从RPA技术的基础理论和实验要点出发概述了开展该项研究需要注意的要点，综述了RPA技术在医学检验领域的应用现状和相关问题，并展望了其未来发展的广泛前景。

目的:建立重组人甘露聚糖结合凝集素蛋白（M1蛋白）磁珠富集病原体结合重组酶辅助聚合酶链式反应（RAP）巢式核酸扩增技术检测血液中白色念珠菌和热带念珠菌的方法，以实现对白色念珠菌血症和热带念珠菌血症的早期诊断。方法:针对白色念珠菌和热带念珠菌的内转录间隔区的高度保守区域的设计引物探针，建立检测白色念珠菌和热带念珠菌的RAP检测方法；用梯度稀释的标准菌株核酸和临床常见的血流感染病原体核酸检验灵敏度、重复性、特异性；用模拟样本进行M1蛋白磁珠富集血浆白色念珠菌和热带念珠菌RAP和实时荧光PCR的检测，并对结果进行比较。结果:建立的双重RAP方法灵敏度为2.4~2.8拷贝/反应，重复性好，特异性高；M1蛋白磁珠富集病原体结合双重RAP方法可在4 h内完成对血浆中白色念珠菌和热带念珠菌的检测，<10 CFU/ml的病原体富集后进行RAP检测样本数较PCR检测样本数多。结论:本研究建立了检测血液中白色念珠菌和热带念珠菌的双重RAP方法，该检测方法具备准确、快速、减少污染物的优点，在念珠菌血症快速检测中具有较好的应用潜力。

目的:对肺炎克雷伯菌(KP)中标注的氨基肽酶(PepA)进行序列扩增与蛋白表达，鉴定其酶活特性。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP PepA基因序列(Reference Sequence：NZ_CP045783.1)设计扩增引物，以本科室前期分离到的一株KP基因组为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增出PepA基因全长，使用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-PepA转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达出KP PepA蛋白，使用N 2＋层析柱对重组His标签蛋白进行纯化。以亮氨酸-对硝基苯胺(Leu-pNA)为底物，测定KP PepA对其水解能力，并摸索不同的反应温度和pH值条件对水解反应的影响。在反应体系中加入不同二价金属离子，观察各离子对KP PepA氨基肽酶活性的作用。组间比较采用 t检验。 结果:扩增出长度为1 527 bp的KP PepA基因，并获得可溶性KP PepA蛋白，大小为56.1×10 3，与预测大小一致。KP PepA加入组反应产物pNA浓度显著高于KP PepA不加组[(205.00±5.00) μmol/L比(8.00±2.00) μmol/L， t＝63.36， P<0.01]，表明重组KP PepA可以水解Leu-pNA。KP PepA水解Leu-pNA的最适温度为37 ℃，最适pH值为pH 8.0。Co 2＋、Mn 2＋均可以提高KP PepA酶活性，其中Co 2＋激活作用最强，加入Co 2＋组的相对酶活性显著高于不加离子组(181.70±7.64比95.00±0.00， t＝16.44， P<0.01)；Zn 2＋、Fe 2＋均可以抑制KP PepA酶活性，其中Zn 2＋抑制作用最强，加入Zn 2＋组的相对酶活性显著低于不加离子组(44.67±8.97比95.00±0.00， t＝8.49， P<0.01)。 结论:肺炎克雷伯菌中标注的PepA具有体外氨基肽酶活性。

目的:原核表达糖尿病创面来源大肠杆菌谷氧还蛋白(Grx)GrxB，制备GrxB多克隆抗体。方法:根据美国国家生物技术信息中心(NCBI)公布的大肠杆菌K12标准株grxB基因序列(Gene ID：946926)设计扩增引物，以本科室前期分离到的一株糖尿病创面大肠杆菌基因组(煮沸裂解法获得)为模板，通过聚合酶链反应(PCR)扩增出grxB全长663 bp，使用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接至表达载体pET-30a。将重组质粒pET-30a-grxB转化至大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GrxB蛋白，使用N 2+镍离子层析柱对蛋白进行纯化。纯化后的重组GrxB蛋白免疫BALB/c小鼠，完成免疫程序后使用蛋白质印迹法(Western blot)和间接酶联免疫吸附试验(ELISA)对多克隆抗体的特异性和效价进行测定。两组间比较采用 t检验。 结果:经测序，扩增出的grxB序列与K12标准株的完全一致，并成功表达出可溶性重组GrxB蛋白，大小为31.2 kDa，与预测大小一致。血清51 200倍稀释后，免疫组效价显著高于磷酸盐缓冲液(PBS)组(1.146±0.066比0.12±0.011， t＝15.000， P<0.05)，免疫组血清与重组GrxB蛋白和大肠杆菌全菌均具有良好的特异性反应。 结论:成功表达可溶性重组GrxB蛋白，并获得高滴度多克隆抗体。

目的:探讨肠炎沙门菌 spvD基因对人克隆结肠腺癌Caco-2细胞侵袭力及胞内增殖力的影响。 方法:利用自杀质粒介导的同源重组技术构建 spvD基因缺失株，PCR扩增并克隆 spvD基因于pBAD33表达载体获得回补质粒，导入相应缺失株得到回补株，并将pBAD33导入野生株及缺失株作为空载对照。荧光定量反转录聚合酶链式反应检测 spvD mRNA表达水平。以Caco-2细胞作为体外模拟人肠上皮细胞模型，分别将野生株、缺失株及回补株与其共培养，探究 spvD基因对Caco-2细胞的毒力。使用LSD- t检验进行3组间 spvD mRNA表达水平比较及胞内活菌数比较，使用χ2检验进行3组间侵袭率的比较。 结果:以野生株 spvD mRNA表达量作为单位“1”，缺失株为“0.00”、回补株为“2.60”（LSD- t野生株，缺失株=1.11， P=0.31；LSD- t野生株，回补株=-1.77， P=0.13；LSD- t缺失株，回补株=-2.88， P=0.03），该结果证实了缺失株及回补株的成功构建。上述3组肠炎沙门菌对Caco-2细胞的侵袭实验结果显示，野生株侵袭率为0.23%，缺失株侵袭率为0.16%，回补株侵袭率为0.16%，差异无统计学意义（χ 2=1.13， P=0.570）。通过比较细菌干预Caco-2细胞后不同时间点胞内活菌数，发现在干预16 h时，野生株（6.50×10 6 CFU/ml）、回补株（7.25×10 6 CFU/ml）胞内活菌数明显增多，均高于缺失株（1.90×10 6 CFU/ml）（LSD- t野生株，缺失株=7.95， P=0.00；LSD- t野生株，回补株=-1.27， P=0.25；LSD- t缺失株，回补株=-9.22， P=0.00）。 结论:尚不能认为 spvD基因影响肠炎沙门菌对Caco-2细胞的侵袭力，但该基因可促进肠炎沙门菌在Caco-2细胞内增殖。

重组酶聚合酶扩增技术作为一种新型的核酸恒温扩增检测技术，近年来已经展现出其巨大的应用潜力和发展前景。高敏感度、高特异度、对仪器依赖程度低以及可整合多种检测模式等独特的优势，使其在多个领域，特别是基层和现场即时检测中具有广泛的应用价值。本文对重组酶聚合酶扩增技术的发展历程、检测原理、研究动态及应用进展进行综述，并对其未来发展进行展望，以期为基于重组酶聚合酶扩增技术的病原体快速检测方法的研发和临床应用提供有益参考。

目的:评估单核苷酸多态性微阵列（single nucleotide polymorphisms array，SNP-array）技术和第二代高通量测序（next generation sequencing，NGS）技术在胚胎植入前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）中的检测能力和效率。方法:回顾性描述分析2020年1月至2022年8月期间于广西壮族自治区妇幼保健院生殖中心就诊、夫妇双方均携带有明确致病性基因突变并要求进行第三代试管婴儿助孕的188例患者资料。经卵胞质内单精子注射授精和体外培养后，共收获995枚囊胚并进行活检。患者胚胎细胞遗传物质经全基因组扩增之后，分别采用SNP-array或NGS分析其携带致病基因突变和染色体拷贝数变异（copy number variation，CNV）的情况，同时采用Sanger测序或间隙聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）对突变进行直接检测。分析女方年龄和获囊胚数的关系、胚胎携带突变和致病性CNVs的比例，比较不同分子诊断技术在PGT中的检测成功率和准确性。经遗传学检测后，选择合适的胚胎进行子宫腔内移植，并于中孕期进行羊水穿刺产前诊断。结果:①成功对924个胚胎进行遗传学检测，总的检测成功率为92.9%。根据遗传学检测结果，共有389个（42.1%）胚胎可用于移植。②对胚胎进行缺失型α-地中海贫血突变检测，间隙PCR的成功率［84.9%（465/548）］低于SNP-array［98.7%（81/82）］和NGS［92.5%（431/466）］。对点突变进行检测，Sanger测序的成功率［98.5%（440/447）］与SNP-array［95.6%（110/115）］和NGS［96.1%（319/332）］的差异无统计学意义。有38个胚胎因等位基因脱扣导致直接位点检测法的结果与SNP单体型分析的结果不一致。另外，有4个胚胎因染色体重组导致SNP单体型分析失败。③与NGS相比，SNP-array检测CNV的成功率［83.7%（165/197）］较低，但是可检出更多种类的染色体拷贝数异常。④共进行了152例胚胎移植，其中有107例成功临床妊娠，有69例完成了羊水穿刺产前诊断，有42个健康儿顺利分娩。结论:从检测效率考虑，SNP-array适用于分析胚胎携带多个基因突变、罕见单基因突变或者缺失型突变，而NGS适用于检测常见的单基因突变类型。同时辅以Sanger测序和间隙PCR等技术对突变位点直接进行检测，可进一步提高PGT的检测成功率和准确性。本研究成果可为PGT从业者根据突变类型和患者的需求选择合适的检测平台提供依据。

目的:探究肺炎克雷伯菌(KP)外膜蛋白A(OmpA)是否可以激活Raw264.7巨噬细胞NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体。方法:根据(美国)国家生物技术信息中心(NCBI)公布的KP OmpA基因序列(GenBank Number：AJ000998.1)，以本科室保存的KP菌株基因组为模板，设计引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增OmpA全长序列并经同源重组酶连接至慢病毒表达载体pLVX-AcGFP1-N1。将该重组表达载体与慢病毒包装质粒pLP1，pLP2和pLPVSV-G共转染HEK293T细胞，收集慢病毒液并感染Raw264.7巨噬细胞，经有限稀释法筛选获得表达KP OmpA的Raw264.7单克隆细胞株。使用蛋白质印迹法(Western blot)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-18(IL-18)表达。组间比较采用 t检验。 结果:成功包装出慢病毒并获得稳定表达KP OmpA的Raw264.7细胞系，KP OmpA稳转细胞系胞内NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β灰度值显著高于空载细胞系(1.17±0.01比0.71±0.01， t＝31.170， P<0.01；2.25±0.06比1.43±0.07， t＝8.909， P<0.05；1.82±0.06比1.25±0.01， t＝8.900， P<0.05；1.41±0.06比0.58±0.01， t＝12.860， P<0.01)。KP OmpA稳转细胞系细胞上清中IL-1β和IL-18表达量显著高于空载细胞系[(215.70±14.93) pg/ml比(20.37±9.86) pg/ml， t＝10.920， P<0.01；(115.90±14.88) pg/ml比(15.40±4.72) pg/ml， t＝6.434， P<0.05]。 结论:肺炎克雷伯菌外膜蛋白OmpA可以激活Raw264.7巨噬细胞NLRP3炎症小体，并上调炎性因子IL-1β和IL-18表达。