病毒是一种只含有一种核酸和蛋白质外壳的结构简单的非细胞结构微生物。随着分子生物学的发展，作为重要生物资源，微生物菌(毒)种的保藏价值逐渐得到人们的关注。相对于容易污染微生物的传代法和容易失活的干燥法，低温保藏作为一种便宜、简单、省时的方法，已广泛应用于微生物的保藏当中。但是关于病毒低温保藏的现有研究较少且不深入。基于此，本文根据病毒侵染特定细胞的特性，将病毒分为动物病毒、植物病毒和细菌病毒(噬菌体)，综述保藏温度、低温保护剂以及其它因素对不同种类病毒的低温保藏效果的影响，分析其病毒保藏技术问题及发展趋势，为进一步完善微生物低温保藏的现状研究提供参考。

γ-氨基丁酸可由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化谷氨酸一步合成,反应体系成分简单、环境友好.然而,绝大多数GAD酶催化pH偏酸性且反应范围狭小,需要加入无机盐维持最适催化环境,增加了生产附加成分.此外,随着产物 γ-氨基丁酸的生成,溶液 pH 会逐渐上升,不利于 GAD 酶的持续转化.本研究首先从实验室保藏的一株高产 γ-氨基丁酸的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆得到谷氨酸脱羧酶LpGAD,基于酶蛋白表面电荷修饰,选择 9 个位点进行定点突变及组合突变,酶学性质表征结果显示三突变体 LpGADS24R/D88R/Y309K在催化 pH 区间内酶活力整体提高,尤其拓宽了在偏中性pH 6.0下的酶活,为野生酶的1.68倍.接下来,通过分子动力学模拟解析了酶活提高的机理.此外,将Lpgad与LpgadS24R/D88R/Y309K突变基因分别在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)E01 中过表达,通过优化确定了摇瓶最适转化条件为反应温度40℃,菌体量OD600=20,底物L-谷氨酸 100.0 g/L,5-磷酸吡哆醛添加量为 100 μmol/L.5 L发酵罐中,不调节 pH,通过分批投料底物 L-谷氨酸,γ-氨基丁酸产量高达 402.8 g/L,较对照菌株提高了1.63倍.本研究成功拓宽了LpGAD的pH催化范围及酶活,提高了γ氨基丁酸的转化效率,为实现其规模化工业生产奠定了基础.

[背景]植物根际促生菌在促进植物生长、提高植物系统抗性及改善土壤养分状况等方面具有极大的应用潜力.[目的]为微生物菌肥的开发利用提供高效微生物资源.[方法]采用稀释涂布平板法分离烟草根际土壤可培养细菌,利用PVK培养基筛选具强溶无机磷活性的菌株,结合钼锑抗比色法测定菌株溶磷活性;利用Salkowski's比色液检测菌株产吲哚乙酸(indole acetic acid,IAA)活性;以菌株溶磷量和IAA产量为指标,采用单因素试验设计进行发酵条件优化,以得到菌株溶磷活性和产IAA的最佳发酵方案;基于种子促发芽及幼苗促生长试验验证菌株的促生效果;结合形态学、生理生化和 16S rRNA基因序列对菌株进行分类学鉴定.[结果]于烟草根际土壤分离得到 127 个不同分类的菌株,10 个菌株具溶无机磷的能力,其中菌株SH-1464 溶磷活性最强,溶磷圈直径为 16.11 mm,溶磷量为 119.22 mg/L;Salkowski's比色结果表明,菌株具有极强的产IAA活性,为 39.88 μg/mL.单因素试验结果表明,菌株SH-1464 溶磷的最佳碳源为 10 g/L葡萄糖,最佳氮源为 0.5 g/L蛋白胨,最佳无机磷源及其添加量为 2.5 g/L磷酸三钙,最佳初始pH值为 7.5,温度 30℃,转速 200 r/min;菌株SH-1464 产IAA最佳培养条件为:麦芽糖 10 g/L,酵母粉 5 g/L,NH4NO3 10 g/L,氯化钾 2.5 g/L,L-色氨酸 0.1g/L,pH 6.5,温度 30℃,转速 180 r/min.基于单因素试验结果进行优化前后菌株溶磷量及IAA产量对比试验可知,优化后菌株的溶磷量为 225.9 mg/L,提升 84.5%;IAA产量为 75.3 μg/mL,提升 88.8%.促生试验结果表明:菌株SH-1464 处理下番茄种子的发芽率提高 84.5%,株高提高 55.1%,茎围提高 32.5%,根长、根重分别提高 16.4%和 149%,地上部分鲜重和干重分别提高 172.2%和 203.6%.结合形态学和分子生物学鉴定菌株SH-1464 为拟蕈状芽孢杆菌(Bacillus paramycoides,GenBank登录号为ON417365,保藏号为CCTCCM 2022924);此外,菌株还具有产蛋白酶、产纤维素酶、固氮、分泌铁载体的能力.[结论]菌株SH-1464 具有强溶无机磷、固氮、分泌 IAA、产蛋白酶、产纤维素酶及分泌铁载体等能力,可显著提高番茄种子的发芽率,对番茄幼苗株高、茎围、根长、根重、地上部分鲜重和干重等农艺性状具有显著促进作用,可作为高效微生物资源在微生物菌剂的开发利用等方面展现广泛应用前景.

乳酸乳球菌能有效定植在人体肠道内,抑制有害菌的增殖,保护肠道,增强人体健康.但乳酸乳球菌在实际应用中的一大难题是难于保存其活性,尤其是冷冻保藏过程中.本实验通过单因素实验和正交实验确定最优保护剂组合为30％海藻糖,20％蔗糖,30％脱脂乳和10％甘油,使乳酸乳球菌的冷冻存活率达到91.96％.进一步研究不同的冷冻降温速率和解冻温度对乳酸乳球菌存活率的影响,发现降温速率在-20 ℃/min,解冻温度在0℃时,乳酸乳球菌的存活率最高,达93.14％.

[背景]金针菇(Flammulina velutipes)是我国一种重要的栽培食用菌,年产量超过250万t,规模已跃居世界首位.菌种保藏技术是金针菇栽培和新品种研发的基础,但相关研究十分薄弱,已成为制约我国金针菇产业进一步发展的瓶颈问题.[目的]探索不同保藏因素对金针菇优良菌种中短期保藏的影响,为建立高效、低成本、易操作的保藏方法奠定基础.[方法]以温度、甘油、海藻糖、甘露醇以及保护剂体积5个因素进行正交试验.经12个月保藏,考察金针菇菌种在木屑培养基中的菌丝生长速度,通过极差分析和回归分析解析保藏因素的效应.[结果]温度、海藻糖、甘油和甘露醇对金针菇菌种的中短期保藏有极显著的影响,保护剂体积的影响不显著.温度是最重要的影响因子,与其它4个因素的互作效应均达到极显著水平.20℃是较好的短期保藏温度,-80℃为理想的中期保藏温度.渗透型与非渗透型保护剂间的互作效应对金针菇菌种的中短期保藏有极显著影响,海藻糖和甘露醇间的互作效应不显著.高浓度的海藻糖、甘油及甘露醇均不利于金针菇菌种的中短期保藏.保藏效果较佳的保护剂为10％甘油和0.3 mol/L甘露醇混合液.[结论]建立的菌种中短期保藏方法填补了金针菇产业发展的空白,研究结果可为其它大型真菌的中短期保藏提供重要参考.

[背景]煤地质产甲烷微生物菌群可以代谢煤基质产生甲烷,对于实现煤层气资源的再利用具有重要意义.[目的]检测产甲烷菌群在保藏过程中群落结构的动态变化以及在产气实验中甲烷气的生成情况,以验证保藏方法的可行性,同时为煤层气的微生物增产奠定基础.[方法]分别于不同温度条件下比较3种菌种保藏方法,即甘油/L-半胱氨酸法、富营养法和煤基-基础盐法.通过产气实验检测不同保藏条件下产甲烷菌群的活力.同时,采用454高通量测序技术测定16S rRNA基因序列,分析25℃条件下煤基-基础盐菌种保藏过程中微生物群落结构的变化.[结果]比较了9组菌种保藏方法,发现菌种最佳保藏条件为25℃的煤基-基础盐保藏.在该条件下保藏的产甲烷菌群活性最高,甲烷生成量最大.以无烟煤为碳源进行产气实验时甲烷生成量为12％-25％,而以褐煤为碳源时甲烷生成量可达24％-73％.在25℃的煤基-基础盐菌种保藏条件下,保藏初期细菌的主要优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas),而古菌的主要优势菌为甲烷八叠球菌属(Methanosarcina).随着保藏时间的增加,细菌的群落结构变化显著,发酵细菌及产氢产乙酸细菌成为优势细菌,古菌的群落结构则相对稳定.[结论]菌种保藏的最佳条件为25℃的煤基-基础盐,保藏的产甲烷菌群能长期维持在较高的活性状态,具有较好的产甲烷能力.

目的 研究注射用苏子油氧化稳定性及筛选优良的抗氧化剂.方法 以全氧化值为指标,考察温度、光照及氧气对注射用苏子油氧化稳定性影响,并研究抗氧化剂在注射用苏子油自动氧化及光氧化过程中抗氧化效果.结果 随温度升高注射用苏子油氧化稳定性下降,低温适于其储藏;光照使注射用苏子油快速氧化,避光利于其保藏;空气组较充氮气组氧化剧烈.抗氧化实验发现,在注射用苏子油自氧化及光氧化中,抗氧化剂丁基羟基茴香醚(butylated hydroxyanisole,BHA)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene,BHT)、没食子酸丙酯(propyl gallate,PG)、抗坏血酸棕榈酸酯(L-ascorbylpalmitate,AP)及维生素E(vitamin E,VE)均有抗氧化作用,其中复合抗氧剂VE+AP对注射用苏子油抗氧化效果最强,其在空气、避光、60℃条件下自氧化10 d过氧化值、甲氧苯胺值较不添加抗氧剂组分别降低约60.34％、38.39％,全氧化值降低59.32％;其在空气、室温(17 ～25)℃、(4 500±500)1x条件下光氧化10 d过氧化值、甲氧苯胺值较不添加抗氧剂组分别降低约59.64％、43.17％,全氧化值降低约51.37％,推测由于VE为优良的自由基清除剂,而AP有较强的氧结合能力,协同发挥抗氧化作用.结论 注射用苏子油在低温、避光及充氮的条件下并添加质量分数0.2‰VE+0.05‰AP抗氧剂保存,其全氧化值处在较低水平,且气味色泽良好,达到最好的稳定性效果.

2016年我国畜产品总产量8364万吨,位居全球第一 ,然而我国鲜肉制品常在裸露状态下储存、运输和销售,因其富含营养物质,极易引起微生物的污染与繁殖,导致肉品腐败变质[1-2]. 传统的肉品保藏技术主要有低温冷藏、加热处理、发酵处理及辐射保鲜等[3] ,这些技术主要通过控制酶活性和微生物的生存环境(如水分活度、温度等)来减缓肉品的腐败变质速率. 另一方面,也有真空、气调以及选用合适的包装材料等包装方法来调节和控制包装内环境气体成分和浓度,达到抑制腐败延长保质期的目的.

为了从经过高温烘烤过的烟草叶片中获得功能菌株,采用固体分离培养基,从豫烟10浓香型烟草品种烤烟叶片中分离获得一株内生细菌,编号为CKYG.结果 表明:该菌株在牛奶琼脂鉴别培养基上产生明显的透明圈,发酵液的蛋白酶活性测定进一步确认CKYG菌株具有产蛋白酶活性功能.对温度、pH、接种量和种龄四个因素对CKYG产酶的影响进行了测定,结果显示,CKYG菌株最适宜的发酵产酶温度为40℃,适宜pH为7.0,适宜接种量为3％,适宜种龄为36 h;CKYG菌株可以耐受50℃的生长温度,故可定性为中温菌.通过综合CKYG菌株的形态特征、生理生化特征及16S rDNA序列的聚类分析结果,将其确定为土芽胞杆菌属Geobacillus菌株,暂命名为Geobacillus sp.CKYG,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号CCTCC:M2015116.RYXP菌株可作为蛋白酶开发、烤烟品质调控、烟杆废物发酵和堆肥发酵等应用领域的备选微生物资源.

裸脚菇0612-9次级代谢产物具有强烈抗青绿霉活性,可作为微生物源防腐剂用于柑橘保藏,但是其发酵周期长,产出能耗大效率低.用摇瓶对裸脚菇0612-9的液体菌种培养基、培养条件进行优化并对优化后液体菌种接种种龄、接种量进行探索,最后用5L发酵罐进行放大发酵验证.取样计数测定菌丝球数量、过滤称重测定菌丝干重、HPLC监测活性物质Ⅱ的积累、牛津杯法评价抗青绿霉活性.经研究最佳碳源为玉米粉和麦芽糖,最佳氮源为蛋白胨,最佳液体菌种培养基组成为:玉米粉30g/L、麦芽糖10g/L、蛋白胨15g/L、KH2PO4 2g/L、MgSO4·7H2O 1g/L;最佳培养条件:起始pH5、接种3×φ7mm菌块、装液量100mL/250mL三角瓶、温度28℃、转速160r/min;优化前菌丝球数46个/10mL,菌丝干重0.28g/100mL,优化后菌球数达985个/10mL,菌丝干重达0.69g/100mL,分别为优化前的21.4倍、2.43倍;后续发酵使用种龄9d的液体菌种、接种量7.5％.优化后液体菌种在发酵罐中后续发酵周期从10d缩短至5d,缩短50％,产量比优化前提高8.28％.