目的:探究沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)通过调控骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化与H型血管生成对老年骨质疏松状态下骨缺损愈合的作用,并探讨其具体分子机制.方法:利用免疫组织化学染色检测小鼠骨组织中SIRT1表达的增龄性改变.使用SIRT1激活剂SRT1720与抑制剂EX527作用于BMSCs,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)与Western blot检测成骨标志物以及促H型血管形成因子的表达变化,免疫荧光染色与Western blot检测上述过程中Wnt/连环蛋白β(β-catenin)信号通路变化.构建老年骨质疏松骨缺损模型,SRT1720与EX527作用的同时,分别给予Wnt信号通路抑制剂XAV939与激活剂CHIR-99021,Micro-CT、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)/Masson染色与免疫荧光染色检测各组骨缺损区域新骨形成与H型血管含量差异.结果:小鼠骨组织中SIRT1表达呈现增龄性下调趋势.SIRT1能够促进成骨因子碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、矮小相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)和促H型血管形成因子slit同源物3(slit homolog 3,SLIT3)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达,并促进老年骨质疏松骨缺损区域内H型血管形成与骨再生,且上述作用由Wnt/β-catenin信号通路介导.结论:SIRT1能够通过调控Wnt/β-catenin信号通路促进BMSCs成骨分化与H型血管生成,进而促进老年骨质疏松小鼠的骨缺损愈合.

目的:基于转录组测序技术探讨电针干预对膝骨关节炎软骨表达谱的影响.方法:12只新西兰兔按体质量随机分为空白组(4只)及KOA造模组(8只),KOA造模组应用改良Videman法制动6周复制KOA兔模型,拆除固定装置后根据Lequesne评分再随机分为模型组和电针组(每组4只),干预4周.干预后进行行为学评价,对兔膝关节软骨进行转录组学测序并进行GO和KEGG富集等生物信息学分析.结果:干预后,与模型组比较,电针组Lequesne评分显著降低(P＜0.01);与空白组比较,模型组共筛选出1 055条差异基因,GO分析生物过程主要涉及炎症反应、免疫反应、血管生成和细胞外基质组织等功能,KEGG分析主要富集细胞因子受体相互作用、吞噬体、EB病毒感染和细胞粘附等通路;与模型组比较,电针组初步筛选出396条差异表达基因,进一步GO分析(生物过程)主要涉及炎症反应、免疫反应以及细胞外基质组织等功能,KEGG分析主要富集细胞因子受体相互作用、吞噬体、补体和凝血级联反应等通路;通过交集分析得到电针干预KOA的主要分子机制为白细胞激活、对细菌反应和炎症反应等白细胞-炎症反应,防御反应、免疫反应和对外部刺激反应等免疫功能.结论:在关节软骨层面,电针干预KOA主要通过影响白细胞-炎症反应、免疫功能等表达谱变化而发挥治疗作用.

目的:基于网络药理学和分子对接技术探讨车前子治疗高尿酸血症(hyperuricemia,HU A)的作用机制,以期为车前子治疗高尿酸血症的研究提供思路.方法:根据前期对车前子入血成分研究结果确定车前子的潜在药效成分,结合药物靶点数据库(TTD)、人类在线孟德尔遗传(OMIM)数据库、GeneCards数据库筛选高尿酸血症的作用靶点,进而确定成分与疾病的交集核心靶点,利用Cytoscape 3.8.0软件构建"成分-靶点-疾病网络",并对靶点进行GO富集分析与KEGG通路富集分析,再采用分子对接技术与实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术对结果进行验证.结果:共得到85个成分与疾病的交集靶点,包括胱天蛋白酶3(CASP3)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARG)、白细胞介素-6(IL-6)、雌激素受体1(ESR1)等,GO富集分析在生物过程、细胞组分和分子功能三个层面上分别得到56、15和18个GO功能条目,KEGG通路富集分析得到肿瘤坏死因子、代谢信号转导、胰岛素抵抗、缺氧诱导因子-1等信号通路.分子对接结果显示主要活性成分与核心靶蛋白间的结合性能较好;RT-qPCR结果表明,与模型组比较,车前子给药组大鼠肾脏组织中Ras与p38mRNA的表达水平显著升高,差异有统计学意义(P＜0.01).结论:本研究建立了车前子干预高尿酸血症的"成分-靶点-通路"网络,为系统阐释车前子治疗高尿酸血症的分子机制提供了参考.

目的 探讨京尼平对大鼠肾移植缺血再灌注损伤的作用机制.方法 将36只健康成年雄性SD大鼠按照随机数字表法分为4组:对照组(Control)、假手术组(Sham)、肾移植组(KT)、京尼平干预组(GP),Control组和Sham组,每组6只,KT组和GP组供、受体每组各6只.采用大鼠原位肾移植模型,GP组术前1 h予50 mg/kg京尼平灌胃.于术后24 h获取大鼠血清和肾脏组织.采用苏木精-伊红(HE)染色观察肾组织病理结果;酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平,大鼠肾组织超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平;用脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测肾组织细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肾组织中腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、沉默信息调节因子-1(SIRT1)和解耦联蛋白2(UCP2)的蛋白表达.组间比较采用独立样本t检验.结果 HE结果显示,KT组大鼠肾脏有炎性细胞浸润、肾小管萎缩变性、间质细胞水肿、皮质出血,GP组肾组织结构损害较轻.ELISA结果显示,GP组血清 Scr、BUN 和肾组织 MDA 低于 KT组(42.06±4.03 比 53.18±3.59、28.82±2.31 比42.49±5.05、4.01±0.39 比 5.13±0.31,i=5.04、6.03、5.42,P＜0.05),而 SOD 水平高于 KT 组(8.58±0.75比6.88±0.45,t=4.77,P＜0.05).TUNEL检测结果显示,GP组大鼠肾组织细胞凋亡率低于 KT组(3.53±1.795 比 17.53±6.91,t=4.81,P＜0.05).Western blot 结果显示,GP 组AMPK、SIRT1 蛋白表达水平高于 KT组(1.07±0.17 比 0.52±0.11、0.84±0.15 比 0.48±0.23,t=6.49、3.29,P＜0.05),而UCP2 蛋白表达水平低于 KT组(0.85±0.20 比 1.18±0.07,t=3.89,P＜0.05).结论 京尼平可能通过激活AMPK/SIRT1通路减轻移植肾缺血再灌注损伤.

目的:探讨活化的巨噬细胞对大鼠晶状体损伤后视神经损伤修复的影响.方法:选用普通级成年健康Wistar 大鼠45 只,随机平均分为3 组:正常对照组不做任何处理;NC组给予视神经横断性损伤;NC+LP组先给予视神经横断性损伤,再给予晶状体损伤.术后第7、14、21 天每组分别处死大鼠5 只,免疫组化染色方法检测视网膜组织中ED-1 的表达,免疫荧光法检测GAP-43 的表达.结果:术后第7、14、21 天,正常对照组及NC组视网膜中均未见ED-1 阳性细胞;NC+LP组ED-1 阳性细胞计数分别为(58.27±4.79)、(45.39±5.13)、(21.17±3.40),第 7天时表达最强,之后降低(P<0.001).术后第7 天NC组神经节细胞层可见少量GAP-43 表达,高于正常对照组,之后表达降低;NC+LP组各时间点GAP-43 表达均大于NC组(P<0.05),术后第 14 天表达最强(P<0.05).结论:激活巨噬细胞可促进晶状体损伤后视神经轴突再生.

目的:探讨栝楼桂枝颗粒是否通过HIF-1α-Netrin-1-UNC5B/VEGF促进脑缺血后血管生成和神经功能恢复.方法:随机选取32只SD大鼠建立大脑中动脉闭塞再灌注损伤模型,造模成功后分为模型对照组、栝楼桂枝颗粒3.6 g/kg组,另设16只假手术对照组.各组灌胃给予相应药物或生理盐水,采用改良神经功能缺损(mNSS)评分、肌张力测评试验及Cat Walk步态分析系统评价各组大鼠神经功能恢复情况;采用MRI检测各组大鼠脑梗死面积,计算脑梗死率;采用免疫组化法、蛋白免疫印迹法(West-em blot)检测各组大鼠促血管生成及HIF-1α通路相关蛋白的表达.结果:与假手术对照组比较,模型对照组mNSS评分和肌张力评分均显著升高,运动时间和最大速率变化均显著升高(P＜0.01),大鼠大脑检测出大片白色梗死区域,脑梗死面积显著增加;缺氧诱导因子(HIF-1α)蛋白表达明显升高,大鼠缺血侧大脑皮层组织中白细胞分化抗原(CD34)阳性表达率明显升高(P＜0.05);与模型对照组比较,栝楼桂枝颗粒3.6 g/kg组大鼠神经行为学评分、肌张力明显降低(P＜0.05或P＜0.01),脑梗死率显著减少,大鼠运动时间显著降低(P＜0.01);血管生成相关蛋白VEGFA、CD34蛋白表达明显上调(P＜0.05或P＜0.01),HIF-1α、神经导向因子-1蛋白(NETRIN-1)、神经导向因子受体(UNC5B)蛋白表达明显上调(P＜0.05或P＜0.01).结论:栝楼桂枝颗粒能够促进缺血性脑中风后的血管生成和神经功能恢复,其作用机制可能与激活HIF-1α-NETRIN-1-UNC5B/VEGF信号通路有关.

目的 探讨帕罗西汀对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCS)成骨分化的影响及机制.方法 从大鼠后肢分离培养原代BMSCS,流式鉴定BMSCS表面标志物.细胞计数试剂盒(CCK-8)法测定不同浓度的帕罗西汀对BMSCS的细胞毒性,采用1.25、2.50、5.00 μmol/L的浓度处理BMSCS.细胞分为GM组(生长培养基培养)、OS组(成骨诱导培养基培养)、LP组(1.25 μmol/L帕罗西汀+成骨诱导培养基培养)、MP组(2.50 μmol/L帕罗西汀+成骨诱导培养基培养)、HP组(5.00 μmol/L帕罗西汀+成骨诱导培养基培养).1周后进行碱性磷酸酶(ALP)染色,3周后茜素红染色检测成骨分化水平.3周后提取细胞全蛋白,通过蛋白质印迹法(Western blot)检测成骨标志物OPN、Runx2的表达水平及核因子-κB(NF-κB)、磷酸化核因子-κB(p-NF-κB)的表达水平.添加NF-κB抑制剂PDTC后再次分组为OS、OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC、HP+PDTC组,同样分别进行ALP染色、茜素红染色及Western blot检测成骨分化水平和NF-κB表达水平.两样本间对比采取t检验,多组间差异采用单因素方差分析.结果 流式细胞检测CD73、CD90、CD29、CD44表达阳性,CD34、CD45表达阴性.OS组BMSCS的ALP染色和茜素红染色颜色较深,LP、MP、HP组染色较浅.GM 组 p-NF-κB 表达量低于 OS、LP、MP、HP 组(0.458±0.012 比 0.567±0.008、0.749±0.022、0.802±0.011、0.972±0.014,t=13.137、13.443、29.318、43.010,P＜0.05);NF-κB 表达量 OS 组与GM、LP、MP、HP 组差异无统计学意义(1.006±0.025 比 1.007±0.013、0.945±0.074、0.909±0.101、0.982±0.019,t=0.024、1.363、1.627、1.335,P＞0.05);Runx2 表达量 OS 组高于 GM、LP、MP、HP 组(0.955±0.011 比 0.585±0.014、0.746±0.012、0.584±0.016、0.489±0.013,t=36.083,21.910、33.210、67.948,P＜0.05);OPN 表达量 OS 组高于 GM、LP、MP、HP 组(0.918±0.015 比0.669±0.037、0.666±0.028、0.538±0.043、0.421±0.028,t=10.834,13.859、14.370、27.067,P＜0.05).OS、OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC、HP+PDTC 组 ALP 染色和茜素红染色程度基本相同.p-NF-κB 表达量 OS 组高于 OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC 组 HP+PDTC 组(0.790±0.044比 0.450±0.032、0.439±0.015、0.481±0.020、0.449±0.024,t=10.821,12.956、11.024、11.705,P＜0.05);NF-κB 表达量 OS 组与 OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC、HP+PDTC 组差异无统计学意义(0.866±0.019 比 0.843±0.038、0.818±0.028、0.845±0.045、0.859±0.068,t=0.930、2.404、0.722、0.178,P＞0.05);OPN 表达量 OS 组与 OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC、HP+PDTC 组差异无统计学意义(0.902±0.032 比 0.925±0.041、0.890±0.052、0.963±0.042、1.003±0.093,t=0.785、0.311、2.004、1.789,P＞0.05);Runx2 表达量 OS 组与 OS+PDTC、LP+PDTC、MP+PDTC、HP+PDTC 组差异无统计学意义(0.967±0.052 比 0.898±0.095、0.951±0.015、0.950±0.055、0.921±0.055,t=1.113、0.532、0.392、1.068,P＞0.05).结论 帕罗西汀可以通过激活大鼠BMSCS的NF-κB抑制大鼠BMSCS的成骨分化.

目的:探讨山楂有机酸通过缺血后适应保护心肌缺血再灌注(I/R)损伤的作用机制.方法:采用Langendorff离体心脏灌流装置对SD大鼠心脏进行缺血再灌注并记录心脏动力学改变,从再灌注期开始全程在灌流液中给予不同浓度的山楂有机酸.采用三苯四唑氯(TTC)染色评估心肌梗死面积.采用CellTiter 96 ?溶液细胞增殖法测定心肌细胞存活率;流式细胞仪检测H2O2(过氧化氢)诱导的心肌细胞凋亡;采用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)释放、细胞内丙二醛(MDA)生成、抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)]活力;以试剂盒检测半胱氨酸天冬氨酸酶-3(Caspase-3)和Caspase-9活力;Western blot法检测线粒体凋亡调控蛋白(BAX和BCL-2)、磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)和磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(p-P38)的表达变化.结果:与空白对照组相比,模型对照组的左心室舒张压显著降低,心肌梗死面积显著增加,细胞活力显著下降(P＜0.01),LDH释放和细胞内MDA生成显著增加(P＜0.01),SOD和GSH-Px的活力显著降低(P＜0.01),Caspase-3和Caspase-9的活力显著增加(P＜0.01),BAX的表达上调,BCL-2的表达显著下调(P＜0.01),AKT和ERK的磷酸化被抑制、P38和JNK的磷酸化被激活(P＜0.05或P＜0.01);与模型对照组比较,山楂有机酸25、100 μg/mL组显著改善了小鼠离体心脏左心室舒张压(P＜0.01),降低了心肌I/R损伤引起的梗死面积(P＜0.01),明显提高了心肌细胞存活率,降低了过氧化氢致心肌细胞损伤的LDH泄漏和MDA生成、提高了 SOD和GSH-Px活力(P＜0.05或P＜0.01),明显降低过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡以及Caspase-3和Caspase-9活力,下调BAX、BCL-2蛋白表达(P＜0.05或P＜0.01),上调p-AKT和p-ERK蛋白表达(P＜0.05),下调p-JNK和p-P38的蛋白表达(P＜0.01),PI3K特异性抑制剂LY294002、JNK和P38特异性激动剂Anisomycin以及ERK特异性抑制剂PD98059降低山楂有机酸100 μg/mL对过氧化氢引起的细胞存活率升高和Caspase-3活力的降低(P＜0.05或P＜0.01).结论:PI3K/AKT和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路可能介导了山楂有机酸通过缺血后适应提高抗氧化酶活力、抑制心肌细胞凋亡,保护心肌I/R损伤的作用.

目的 探讨慢性间歇低氧(CIH)和复氧对大鼠胰岛素抵抗(IR)及骨骼肌miR-27a-3p/PPARγ/IRS1/PI3K/AKT表达的影响.方法 从基因表达数据库(GEO)中下载CIH条件下miRNA数据集,运用DESeq2筛选差异表达最显著的miRNA作为研究对象,使用miRNA walk网站对差异miRNA的靶基因进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析,并Cytoscape软件构建miRNA-mRNA-pathway调控网络.将48只雄性SD大鼠随机分为对照(CON)组和CIH组,24只/组,CON组常氧环境饲养12周,CIH组先予CIH环境饲养8周,再恢复常氧饲养4周.两组均在基线、8周、12周时留取血样和骨骼肌组织,检测空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平,HE染色观察骨骼肌病理改变并计算肌纤维横截面积,实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和Western blotting法检测骨骼肌miR-27a-3p、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、胰岛素受体1(IRS1)、p-IRS1、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、磷酸激酶B(AKT)、p-AKT表达,比较组间差异.结果 生信分析发现,GEO数据库未筛选出CIH状态下肌肉组织相关的miRNA数据集,仅得到肾脏组织差异表达miRNA的GSE202480数据集,从CON组和CIH组样本中筛选出165个差异表达的miRNA,选最显著miR-27a-3p作为研究对象.GO和KEGG分析显示,差异miRNA的靶基因主要参与肌肉调节和胰岛素信号传导.miRNA-mRNA-pathway调控网络显示miR-27a-3p是PPAR信号通路和PI3K/AKT信号通路的关键调控因子.动物实验发现,基线时,两组各项观察指标均无统计学意义(P>0.05);8周时,与CON组相比,CIH组FBG、FINS、HOMA-IR、PPARγ显著升高(P<0.05或P<0.01),肌纤维排列疏松,肌纤维横截面积、miR-27a-3p、p-IRS1/IRS1、PI3K、p-AKT/AKT显著降低(P<0.05或P<0.01),GLUT4表达呈升高趋势但无统计学意义(P>0.05);12周时,两组各项观察指标均无统计学意义(P>0.05).结论 CIH可导致大鼠IR增加和骨骼肌病理改变,而复氧可以逆转;CIH可致骨骼肌miR-27a-3p表达下调,PPARγ表达上调,IRS1/PI3K/AKT胰岛素信号转导受到抑制,而复氧干预可以逆转;miR-27a-3p可能通过调控PPARγ/IRS1/PI3K/AKT信号通路参与了CIH所致的IR.

目的:利用生物信息学技术筛选并鉴定缺血性脑卒中(IS)的关键基因,基于基因富集分析结合相关实验探讨羟基红花黄色素A(HSYA)对脑缺血损伤后神经元凋亡的影响及机制.方法:从GEO数据库获得IS相关的样本数据,进行差异表达基因(DEGs)分析及基因富集分析,获得关键基因与关键信号通路,并通过体内外实验进行相关验证.建立Sprague-Dawley大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型(MCAO/R),采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)和免疫荧光检测Janus激酶2(JAK2)/信号传导转录激活因子3(STAT3)通路的磷酸化水平及凋亡相关蛋白的表达;线粒体膜电位探针检测线粒体膜电位情况进而明确细胞凋亡水平.利用HT-22海马神经元细胞建立糖氧剥夺/复糖氧模型(OGD/R),使用JAK2/STAT3信号通路抑制剂进一步验证HSYA对神经元凋亡的作用机制.结果:通过生物信息学分析研究GSE22255数据集发现23个显著上调的DEGs和2个显著下调的DEGs.富集分析发现其与脂多糖的反应、细胞凋亡的调控、炎症反应、急性炎症反应调节、分子干预信号通路相关.生物过程方面,通过建立特征基因功能网络发现,特征基因与急性炎症反应、凋亡信号通路的调节、脂多糖介导的反应、稳态分子的反应等功能相关.基因集富集分析显示,肿瘤坏死因子α(TNF-α)介导的核因子κB(NF-κB)信号通路、血红素代谢信号通路、细胞凋亡相关信号通路、JAK/STAT3信号通路、P53信号通路发挥着关键作用.筛选出JAK2/STAT3信号通路和凋亡相关通路为研究重点.与假手术组比较,MCAO/R组大鼠磷酸化JAK2(p-JAK2)、磷酸化STAT3(p-STAT3)和促凋亡相关蛋白表达升高(P＜0.001),抑凋亡相关蛋白表达降低(P＜0.001).HSYA干预后可抑制JAK2/STAT3信号通路磷酸化激活和神经元凋亡(P＜0.01).体外实验显示,OGD/R组JAK2/STAT3通路被磷酸化激活,促凋亡相关蛋白表达较Normal组升高(P＜0.001),抑凋亡相关蛋白表达低于Normal组(P＜0.001);加入抑制剂AG490后JAK2、STAT3磷酸化程度降低(P＜0.01).与Normal组比较,OGD/R组凋亡相关蛋白半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)表达水平升高(P＜0.001),Bcl-2表达降低(P＜0.001).HSYA抑制了神经元的凋亡(P＜0.01).结论:JAK2/STAT3信号通路和凋亡相关信号通路在IS后发挥着关键作用,HSYA可能通过调控JAK2/STAT3信号通路,抑制缺血缺氧后神经元凋亡,从而减轻脑损伤.