豨莶草是我国传统中药,具有广泛的药理作用,比如抗炎镇痛、抗血栓、免疫调节、抗过敏、抗菌、抗疟、抗动脉粥样硬化、抗缺血性脑损伤、抗肿瘤等.化学成分和药理活性研究表明豨莶草中丰富的萜类化合物是豨莶草发挥多种功效的物质基础.豨莶精醇系从豨莶草中分离得到的二萜类化合物,药理作用研究表明豨莶精醇具有良好的抗血小板聚集、抗凝血、改善血液流变学作用.为了发现活性更好、开发价值更高的先导化合物,通过缩酮、氧化、缩合、溴代等系列反应,对豨莶精醇进行了结构修饰研究,得到豨莶精醇衍生物11个(化合物1～11).根据核磁和质谱数据确定了衍生物的结构,并通过以凝血因子Xa(FXa)为靶标的计算机辅助药物设计结合体外抗FXa试验评价了衍生物的活性,结果显示在豨莶精醇的A环上引入三氟甲基噁唑环(化合物9)或者噻唑环(化合物11)时活性明显提高,IC50值分别为0.71±0.07和0.22±0.03 μmol/L,为豨莶精醇结构的进一步优化提供参考,具有一定的研究价值.

目的 探讨不同浓度血必净注射液对内毒素诱导大鼠内皮细胞组织因子(tissue factor,TF)凝血活性的影响.方法 随机将内皮细胞分为对照组、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组(500 ng/mL)、血必净组(1、5、25μL/mL)、LPS+血必净组(1、5、25μL/mL),培养24、48和72 h后采用CCK-8法检测细胞增殖;留取上清,检测乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase,LDH)释放量;以刺激72 h为观察点,采用Western blot技术检测肌醇需求酶1α(inositol-requiring enzyme 1α,IRE1 α)、未剪接型X盒结合蛋白(unspliced-box binding protein-1,uXBP-1)、剪接型X盒结合蛋白(spliced-box binding protein-1,sXBP-1)及蛋白质二硫化物异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)的表达水平;加入Ca2+、凝血因子(coagulation factor,F)Ⅶ和F Ⅹ,用发色底物法检测活化FⅩa水平.结果 与对照组相比,LPS组细胞增殖能力下降,LDH释放增多(P＜0.05),IRE1 d、uXBP1、sXBP1、PDI表达均上调,差异具有统计学意义(P＜0.05).与对照组相比,血必净组细胞增殖能力增强,LDH释放减少(P＜0.05或P＜0.01),随着时间增加,此效应逐渐增强;LPS+血必净组较LPS组细胞增殖活性升高,LDH释放下降(P＜0.05或P＜0.01),RE1α、uXBP1、sXBP1和PDI表达均明显减弱(P＜0.01),FXa产生随IRE1α、XBP1、PDI表达水平降低而减少(P＜0.05),其中LPS+5μL/mL血必净组降低F Ⅹ a效果尤为明显(P＜0.05).结论 血必净注射液能通过阻断IRE1α-XBP1通路,降低PDI的表达,影响内皮细胞TF凝血活性.

口服抗凝药物(NOACs)抗凝效果好,且对正常的凝血级联反应几乎没有影响,仅有很小的内源性促凝血和抗凝血生物活性.但是,由于缺乏有效的拮抗剂,NOACs在使用过程中受到很大的限制.Andexanet alfa 是美国Portola医药公司开发的一种重组凝血因子Xa(FXa)诱导分子,与天然的FXa类似,可竞争性抑制直接和间接FXa抑制剂,有希望成为广谱的针对 FXa 抑制剂类药物的解毒剂.目前,临床前和临床试验已经初步证实Andexanet alfa可抑制直接和间接FXa抑制剂活性,且具有良好的使用安全性.

蛇毒中含有多种能够影响哺乳动物凝血系统的酶类,这些酶类与凝血机制级联放大反应中的各个凝血因子之间有比较严格的专一性作用,其中凝血因子 X激活剂(coagulation factor X activator,FXA)是一种能够直接作用于凝血因子 X(coagulation factor X,FX)的具有蛋白水解酶特性的酶类,在蝰亚科、蝮亚科、眼镜蛇科等蛇毒中分布广泛[1].

目的 从美洲钩虫 (Necator americanus) cDNA中扩增编码NaKuI10基因片段, 构建原核表达系统, 重组表达并纯化rNaKuI10, 采用化学发色法和平板溶解试验等检测其对有关丝氨酸蛋白酶的抑制作用及纤溶活性.方法 根据GenBank MH218867序列, 从美洲钩虫cDNA中扩增出编码成熟肽NaKuI10基因片段并连接入表达载体, 构建原核表达重组质粒pET32a-sumo/NaKuI10, 鉴定正确的重组质粒转化至大肠埃希菌 (Escherichia coli) BL21 (DE3) 中, 用IPTG诱导表达, 超声破碎细菌后用镍亲和层析纯化表达产物, 在纯化柱上用SUMO蛋白酶切割融合标签获得rNaKuI10, 用发色底物法检测rNaKuI10对各丝氨酸蛋白酶的抑制活性, 通过纤维蛋白平板法和纤维蛋白原降解试验观察rNaKuI10对纤溶酶纤溶活性的抑制作用.结果 成功构建了重组质粒pET32a-sumo/NaKuI10, 表达产物纯化后获得可溶性rNaKuI10.2倍及等摩尔比的rNaKuI10分别能抑制100％及90.4％的人纤溶酶活性, 22.4％及10.3％的人胰蛋白酶活性.但1、2、5倍摩尔比的rNaKuI10对人中性粒细胞弹性蛋白酶, 组织蛋白酶G, 蛋白酶3, 胰糜蛋白酶, 胰弹性蛋白酶, 凝血酶, 凝血因子Xa (FXa) 、FXIa、FXIIa、FIXa, 活化蛋白C, 血浆激肽释放酶及FVIIa/TF均无明显抑制作用.rNaKuI10对人纤溶酶的抑制常数 (ki) 为 (0.83±0.10) nmol/L.2 000nmol/L的rNaKuI10接近完全抑制1 000nmol/L的人纤溶酶对纤维蛋白平板中纤维蛋白的溶解作用, 等摩尔比的rNaKuI10可完全抑制人纤溶酶对纤维蛋白原的降解作用.结论 NaKuI10是一种抑制活性强且特异性较好的纤溶酶抑制剂, 其生物学功能还需进一步研究.

目的:探讨重组抗炎、抗凝双效融合蛋白蜱抗凝血肽(TAP)-金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5(SSL5)对动静脉血栓形成的影响和机制.方法:采用基因重组技术构建TAP-SSL5基因,进而制备融合蛋白TAP-SSL5,通过流式细胞检测技术研究重组蛋白TAP-SSL5与粒细胞表面P-选择素糖蛋白配体1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)结合的特性;采用反应底物法在体外检测融合蛋白TAP-SSL5对活化的凝血因子Xa(factor Xa,FXa)活性的抑制作用.采用FeCl3诱导的SD大鼠下腔静脉血栓模型,研究TAP-SSL5对静脉血栓形成的影响;采用FeCl3诱导的C57BL/6J小鼠肠系膜动脉血栓模型,在双光子显微镜下连续检测TAP-SSL5对动脉血栓形成的影响.结果:TAP-SSL5可与粒细胞表面PSGL-1结合,并抑制粒细胞与P-selectin和血小板的结合.TAP-SSL5呈剂量依赖性地抑制FXa活性(P<0.01).体内实验中TAP-SSL5可明显抑制FeCl3诱导的SD大鼠下腔静脉及C57BL/6J小鼠肠系膜动脉血栓的形成.结论:融合蛋白TAP-SSL5具有抗炎和抗凝双重效果,可以明显抑制动静脉血栓的形成.

血栓形成是导致心脑血管疾病的重要诱因, 而抗凝治疗在预防血栓栓塞性疾病中起着很重要的作用.凝血因子Xa (FXa) 是研究新型抗凝血药的一个重要的靶点, 其中, 沙班类抗凝血药是最经典的FXa抑制剂, 近年来发展迅速, 沙班类抗凝血药物具有口服方便、疗效和安全性好, 受食物和其他药物影响小及无需监测国际标准化比值 (INR) 等优点, 在临床上广泛应用并弥补了传统抗凝血药的不足.本文对沙班类凝血因子Xa抑制剂的研究进展进行综述.

抗血栓是预防和治疗心血管疾病的有效方法之一.基于传统中医理论、作者前期研究和相关文献,发现鱼腥草中生物碱类成分具有潜在的抗血栓活性,但是其药效物质基础和作用机制尚未明确.该研究采用分子对接技术虚拟筛选鱼腥草生物碱抗血栓的药效物质,搜集现已经从鱼腥草中报道的70个生物碱类化合物组成配体化合物库,选择P2Y1,P2Y12,凝血因子FⅪa,凝血因子FXa,PAR1,凝血酶等10个与血栓形成密切相关且具有已知晶体结构的靶蛋白作为受体数据库,以Drug Bank中对各靶蛋白有抑制作用并已上市或者即将上市的小分子药物为阳性对照化合物,设定各靶蛋白对应的已上市小分子药物最低打分(S)为阈值,应用Molecular Operating Environment软件(MOE,version 2016)的Dock功能进行分子对接,虚拟筛选出对接评分(S)低于阈值的化合物.对比分析了原配体、已上市药物和鱼腥草生物碱作用于各靶蛋白的主要活性位点,初步揭示了鱼腥草抗血栓活性的作用机制,为抗血栓类药物的研发提供了一定的参考.

andexanet alfa是一种重组的凝血因子Xa(FXa)诱导蛋白,是FXa抑制剂的竞争性拮抗剂.2018年5月3日获FDA批准andexanet alfa用于治疗与利伐沙班及阿哌沙班相关的危及生命或无控制出血后的抗凝逆转.andexanet alfa在FXa结构基础上修饰而获得,与FXa抑制剂具有相同的亲和力而无任何抗凝血活性和促凝血活性.作为首个且唯一FXa抑制剂的特异性拮抗剂,andexanet alfa获得FDA加速批准同时获得突破性疗法及孤儿药资格认定.本文对andexanet alfa的生化特性、临床药理学、临床评价和安全性等进行综述.

目的 探讨凝血因子Ⅹa(FⅩa)抑制剂利伐沙班对内毒素诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)损伤的作用及其机制.方法 体外培养HUVEC,待细胞生长至80%融合时,按随机数字表法分为4组:空白对照组(DMEM培养基)、脂多糖(LPS)组(100 μg/L LPS培养16 h)、FⅩa+LPS组(100 nmol/L FⅩa预处理24 h后加入LPS)、FⅩa+RIV+LPS组(100 nmol/L FⅩa+1 μmol/L利伐沙班预处理24 h后加入LPS).各组细胞处理后用CCK-8细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒检测细胞活性,用细胞划痕实验检测细胞迁移能力,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,用Transwell小室法及伊文思蓝检测单层内皮细胞屏障通透性,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL-1β、IL-6)水平,用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测细胞核转录因子- κB(NF-κB)和丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)炎症信号通路关键蛋白的表达.结果 与空白对照组比较,LPS组细胞活性降低,细胞迁移能力增加,凋亡细胞增多,单层内皮细胞屏障通透性增加, TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子分泌增加,炎症信号通路关键蛋白磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)、磷酸化转化生长因子激酶1(p-TAK1)和磷酸化NF-κBp65(p-NF-κBp65)表达增加,说明LPS可以刺激血管内皮细胞的炎症反应,从而对细胞活性、凋亡及功能有明显影响.FⅩa+LPS组除IL-6水平显著高于LPS组外,其他指标与LPS组比较差异均无统计学意义.与FⅩa+LPS组比较,FⅩa+RIV+LPS组细胞活性明显提高(A值:0.42±0.02比0.33±0.02),细胞迁移能力明显下降(倍:1.78±0.17比2.24±0.20),凋亡细胞明显减少〔(11.30±0.70)%比(21.03±0.19)%〕,单层内皮细胞通透性明显降低〔(149±12)%比(253±15)%〕,炎性因子水平明显降低〔IL-1β(ng/L):163.2±20.7比477.8±20.2,IL-6(ng/L):69.3±0.5比238.0±24.1,TNF-α(ng/L):117.0±13.1比196.2±4.5),炎症信号通路中p-TAK1和p-NF-κBp65蛋白表达水平明显降低(p-TAK1/TAK1 :0.74±0.09比1.85±0.15,p-NF-κBp65/NF-κBp65 :1.15±0.17比2.36±0.20),差异均有统计学意义(均P＜0.05);而p-JNK和p-p38MAPK蛋白表达水平差异无统计学意义(p-JNK/JNK:1.64±0.12比1.65±0.15,p-p38MAPK/p38MAPK :2.31±0.32比2.35±0.20,均P＞0.05).结论 利伐沙班可以有效缓解内毒素刺激HUVEC的炎症反应,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路激活而非MAPK信号通路有关.