目的:分析2017—2018年重庆地区手足口病病原谱及其主要病原体的基因特征。方法:选择重庆市儿童医院作为研究对象，收集并整理该院区2017—2018年1 071例诊断为手足口病患者的核酸检测信息，其中810份已明确了肠道病毒血清型，剩余175份血清型待鉴定，另有86份肠道病毒为阴性。通过病毒分离、核酸浓缩及基因测序等方法对上述261份样本进行鉴定，获得该地区手足口病完整的病原谱。使用MEGA 7.0软件构建四种主要病原体的系统进化树，进行基因特征的研究。结果:通过改良的鉴定方法，261份标本中，除3份被鉴定为人副肠孤病毒（Human parechovirus，HPeV）外，其余258份样本均为肠道病毒阳性。其中CVA6（coxsackievirus A6）血清型占比最多，其次为EV-A71（enterovirus A71）另有CVA16（coxsackievirus A16）和CVA10（coxsackievirus A10）以及其他肠道病毒共计13种血清型。系统进化结果显示，重庆市CVA6血清型均为D3a基因亚型，EV-A71、CVA10和CVA16的优势基因亚型分别为C4a，C2b和B1b，这四种优势基因型与全国其他地区的基因型共同循环进化。结论:本研究通过优化鉴定方法，提高了肠道病毒的检出率，进一步明确了重庆地区手足口病病原谱构成，CVA6是该地区2017—2018年手足口病的主要病原体，其次是EV-A71，同时这两种血清型也是导致重庆地区重症手足口病主要的病原体。

目的:初步了解湖南省人民医院新生儿中副肠孤病毒的流行情况，分析其遗传进化特征。方法:2021年6~9月份在湖南省人民医院采集住院新生儿粪便标本，采用TaqMan real-time qPCR和RT-PCR方法进行人副肠孤病毒(human parechovirus, HPeV)的筛查和分型，采用高通量测序和RT-PCR方法扩增其全基因组，序列测定后进行系统发育分析。结果:共采集新生儿粪便样本123份，其中HPeV阳性为22份，阳性率为17.89%，分型结果显示所有毒株均属于HPeV-1基因型；扩增获得1株HPeV基因组全长为7 269 bp，命名为Hunan/HPeV/2021，该基因组具有典型的HPeV基因组结构；序列比对结果显示该毒株与GenBank中已知的HPeV-1型的基因组核苷酸序列具有最高同源性，为86.6%~91.9%；其编码的唯一的长开放阅读框(open reading frame, ORF)长度为6 540 nt，与已知相似序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为90.3%~92.6%和97.3%~98.3%；系统发育分析显示该病毒株属于HPeV-1型进化分支，与我国流行的HPeV-1型毒株聚为同一分支。结论:在湖南省人民医院新生儿中HPeV具有较高的检出率且均为HPeV-1型。

病毒性脓毒症比细菌性脓毒症少见.目前专业文献较少,但实际发生的患者数量并不少.文献报道的病毒有流感病毒 、肠道病毒 、单纯疱疹病毒 、基孔肯雅病毒等,其中流感病毒脓毒症认识最多;而在儿童疑似脑膜炎或中枢疾病导致的脓毒症的患者中,有观点认为人副肠孤病毒亚型3需要引起重视.涉及的生理状态与临床疾病包括心衰 、肾移植 、维生素代谢异常 、婴儿乳糜胸等,一般是婴幼儿或免疫低下人群易感.拯救脓毒症运动指南第三版 、第四版对病毒性脓毒症都有论述.因为专业认识不足 、微生物学检查手段有限等原因,病毒性脓毒症多有漏诊 、误诊.我们需要明确建立诊断的意识.特殊患者群出现脓毒症表现时,需要把病毒性脓毒症纳入考虑一并进行判断 、处置.本文对病毒性脓毒症的流行病学特征 、病毒种类 、相关疾病 、处置等进行综述.

目的 研究深圳市腹泻儿童中人副肠孤病毒(HPeV)的感染情况和流行特征.方法 收集2016年深圳市5岁以下腹泻儿童粪便标本280例,采用荧光定量PCR方法检测粪便中的HPeV核酸,同时对患者的流行病学资料进行统计分析.结果 2016年深圳地区5岁以下腹泻儿童HPeV的检出率为15.36％(43/280),其中5～ ＜25月龄儿童HPeV检出率较高,且常见合并其他病毒的感染;男性检出率为14.59％(27/185),女性检出率为16.84％(16/95),男女患者检出率的差异无统计学意义(P＞0.05);夏季HPeV的检出率最高(25.64％,30/117),秋季次之(14.29％,11/77),冬季(3.57％,1/28)和春季(1.72％,1/58)的检出率都较低.结论 深圳地区5岁以下腹泻儿童中HPeV有较高的检出率,持续开展HPeV监测有助于进一步明确深圳地区儿童腹泻的病因构成.

目的 探讨2型人博卡病毒(HBoV2)感染与5岁以下儿童急性腹泻的相关性.方法 本研究为前瞻性病例对照研究,以2016年5至12月首都儿科研究所附属儿童医院≤5岁的急性腹泻患儿为病例组,同时期北京龙潭社区医疗服务中心健康查体的相应年龄段无腹泻症状的儿童作为对照组;病例组与对照组各分为8个年龄组:≤1月龄、>1～3月龄、>3～6月龄、>6～12月龄、>1～2岁、>2～3岁、>3～4岁及>4～5岁,每年龄组30例,各入组240例.收集粪便标本,利用实时荧光PCR方法进行包括HBoV2在内的7种腹泻相关病毒筛查;根据循环阈值(Ct)估计HBoV2病毒载量;应用t检验比较组间差异.结果 病例组240例患儿粪便标本中,病毒阳性检出率从高到低依次是诺如病毒16.7% (40例)、轮状病毒10.8%(26例)、HBoV2 7.5%(18例)、腺病毒7.1%(17例)、星状病毒6.3%(15例)、副肠孤病毒3.8%(9例)和爱知病毒0.4%(1例).病例组HBoV2阳性检出率与对照组(5.0%,12例)差异无统计学意义(χ2=1.280,P=0.258),相应的各年龄组间差异也均无统计学意义(P均>0.05),但病例组HBoV2阳性标本的平均病毒载量明显高于对照组[1×109拷贝数/L(Ct值25.8)比1×105拷贝数/L(Ct值33.8),t=0.597,P=0.000].结论 诺如病毒、轮状病毒依然是儿童急性腹泻的重要病毒病原.与低病毒载量的HBoV2相比,高载量的HBoV2更易在5岁以下儿童中引起急性腹泻.

目的 研究深圳地区急性肠胃炎住院患儿中人副肠孤病毒(HPeV)的临床和流行病学特征.方法 收集2017年1月到2018年12月深圳地区5岁以下急性肠胃炎住院患儿粪便标本(常规细菌鉴定为阴性)497份,实时荧光RT-PCR方法检测HPeV,通过巢式PCR扩增VP3/VP1连接区片段进行分型,同时对患儿的流行病学和临床资料进行统计分析.结果 497例患儿中,HPeV的阳性率为8.2％;男性HPeV阳性率为7.6％,女性HPeV阳性率为9.4％(χ2=0.491,P=0.501);0～6月龄患儿HPeV阳性率最高,且92.7％的HPeV阳性患儿月龄<24个月;深圳夏季(7～9月)HPeV的阳性率最高.HPeV阳性患儿主要临床表现为中热(38.1～39℃),腹泻频率平均>6次/d,以黏液便为主,常伴有呕吐,呕吐频率平均每天5次,呕吐物以胃内容物为主.HPeV阳性患儿较阴性患儿在有无呕吐和呕吐物性状差异具有统计学意义.本研究中共检测到HPeV-1(HPeV-1A和HPeV-1B亚型)、3、4、5、6和14在内的6种基因型,其中HPeV-1B(56.1％)为优势流行株,其次是HPeV-1A(17.1％)、HPeV-3(7.3％)、HPeV-4(7.3％)、HPeV-5(4.9％)、HPeV-6(4.9％)和HPeV-14(2.4％).系统进化分析结果显示,大部分深圳分离株与兰州和广州来源的参考株核苷酸序列一致性高.结论 本研究首次在深圳地区5岁以下急性肠胃炎住院患儿粪便中检测到HPeV,且在2017年和2018年有稳定的感染率,检测到6种HPeV基因型别可能与急性肠胃炎相关,HPeV夏季检出率最高,好发于0～6个月患儿,可能是引起急性肠胃炎住院患儿呕吐胃内容物的病因.开展HPeV监测以更充分地掌握其在深圳地区的流行和临床特征,有助于进一步明确深圳地区住院患儿病毒性急性肠胃炎病原谱构成.

目的 检测重组表达草鱼呼肠孤病毒(GCRV)结构蛋白VP6 (GCRV-VP6)的枯草杆菌芽孢(Bacillus subtilis)口服免疫对草鱼肝肠功能影响,以初步评价其作为草鱼出血病候选疫苗的安全性.方法 将前期研究获得的衣壳表达GCRV-VP6的重组枯草杆菌(B.s-CotC-GCRV-VP6)诱导形成芽孢连续口服免疫草鱼6周,在第8周搜集样品,HE染色检测B.s-CotC-GCRV-VP6芽孢口服免疫对肠道组织的病理改变及肠绒毛的影响;扫描电镜观察其对草鱼后肠表面微绒毛及黏膜表面分泌的影响;qRT-PCR检测其对肠道组织紧密连接蛋白(Claudin b、Claudin 3、Claudin 12、Claudin C、ZO-1、Occludin)转录水平的影响;HE染色检测草鱼肝组织病理改变,微板法检测血清转氨酶(AST/GOT,ALT/GPT)活性.结果 HE染色结果显示口服免疫B.s-CotC-GCRV-VP6芽孢后草鱼肠道无坏死,无炎症细胞浸润等病理改变,可促进肠绒毛的生长(与对照组比较P＜0.05);电镜扫描也显示口服重组芽孢可促进肠道黏膜表面微绒毛的生长和分泌孔的增加;qRT-PCR结果显示6种紧密连接蛋白在B.s-CotC-GCRV-VP6组草鱼肠道组织中转录增加,且差异有统计学意义(P＜0.05);HE染色显示,重组芽孢免疫组后草鱼肝组织未见病理性改变;实验组血清转氨酶活性相对降低.结论 重组B.s-CotC-GCRV-VP6芽孢口服免疫草鱼后,其肝肠不产生明显的病理性改变,对肝功能未见明显影响,并可促进其肠道绒毛和微绒毛生长及紧密连接蛋白的表达,可能有利于其肠道的消化吸收和黏膜屏障功能的提高,提示该重组芽孢作为预防草鱼出血病候选口服疫苗对肝肠无副作用.

目的 建立EvaGreen qPCR检测牛腺病毒3型(bovine adenovirus 3,BAV3)的方法,用于牛血清等牛源材料的检测.方法 依据GenBank公布的BAV3标准毒株WBR-1全基因序列,基于E2B区域高度保守序列设计引物,提取并制备DNA标准品,建立EvaGreen qPCR检测BAV3的方法,并对该方法的特异性、灵敏度及精密度进行验证.最后利用该方法检测牛血清中的BAV3,并与细胞培养法及荧光抗体检测对比,以验证该方法的适用性.结果建立的EvaGreen qPCR检测BAV3的方法标准曲线R2＞0.99,扩增效率处于90％～110％,可检测范围为0.2×100～0.2x107copies/μL.实验内Ct值的CV＜2.2％,在不同实验间Ct值的CV＜1.8％.设计的BAV3引物与牛腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、副流感病毒 3 型(parainfluenza virus 3,PI3)、呼肠孤病毒(reovirus,REO)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、狂犬病毒(rabies virus,RV)、羊轮状病毒(Lanzhou lamb rotavirus,LLR)基因组均无交叉反应,特异性良好.采用EvaGreen qPCR对198份新生牛血清进行BAV3检测,阳性检出率为10.1％,检出率高于细胞培养法及荧光抗体检测.结论 成功建立了 EvaGreen qPCR检测BAV3的方法,该方法快速、灵敏、特异、易于标准化,可用于牛血清中BAV3的检测.

目的 探讨深圳市人副肠孤病毒(HpeV)感染的危险因素.方法 回顾性调查分析2016年1月至2017年12月北京大学深圳医院收治的5岁以下腹泻儿童220例,根据HpeV感染情况分为2组:未感染组186例,感染组34例.收集2组患者一般临床资料及可能的危险因素,通过单因素分析和多因素分析识别深圳市HpeV感染的危险因素.结果 单因素分析提示2组患儿神经系统感染、脓毒症、肠炎、轮状病毒感染、呼吸道疾病比较差异有统计学意义(P<0.05);多因素Logistic回归分析提示,神经系统感染(95％CI-3.6598～3.9689,P<0.001)、脓毒症(95％CI-2.5671～2.8762,P<0.001)、肠炎(95％CI-2.9812～3.2903,P<0.001)、轮状病毒感染(95％CI-2.9182～3.2273,P<0.001)、呼吸道疾病(95％CI-2.7356～3.0447,P<0.001)为HpeV感染发生的独立危险因素.结论 深圳地区引起HpeV感染的危险因素包括神经系统感染、脓毒症、肠炎、轮状病毒感染、呼吸道疾病等,因此,患儿一旦发生腹泻应立即送院诊治,以降低不良事件发生率.