目的:设计腹腔镜下肾部分血流阻断器(LPRB)，在兔肾实验中探讨该器械设计的合理性和阻断局部肾组织血流的效果。方法:⑴设计。根据人、猪、兔肾血流均由中心向外周扇形流动的解剖特点，只要压迫肾脏中内侧肾组织，就可以阻断压迫区远端的血流。该器械的设计即以此为依据。阻断器包括第一压迫臂、第二压迫臂及转轴，内置扭力弹簧使得这两个压迫臂的末端自动闭合，压迫臂的末端设置有压迫组件，其上设置有多个自适应压迫片。⑵制作。以钛合金材料利用3D打印机打印成品。⑶实验。新西兰成年兔5只，麻醉后半侧卧位固定于手术台上，侧腹部切口，暴露肾脏，仅保留肾蒂血管。根据阻断血流方法不同分为常规组和LPRB组以进行自身对照。观察阻断血流效果。检测LPRB夹持力，肉眼和病理观察夹持部位组织损伤程度。结果:LPRB已获实用新型和外观专利授权。3D打印钛合金材料器械成品成功。实验中，该器械轻松打开放置和移除；两个压迫臂在扭力弹簧的作用下自动闭合并固定；压迫臂可以根据夹闭部位的不同调整压迫臂的角度以适应之；自适应压迫片可以倾斜，与肾脏外形相吻合，具有自适应性；该器械压迫力度足够，止血彻底，肾实质钳夹与阻断肾蒂的止血效果相当。器械夹持力值平均为132 g。肉眼及病理检查结果未发现明确肾组织损伤。结论:LPRB结构设计基本合理、使用安全，能够实现切除部分的局部止血，同时保证了其他部位的血流。但器械较大、自适应组件较硬的缺点今后需要改善。

目的:构建基于血管化机制的骨不连类器官芯片，并探讨无菌性骨不连发生机制。方法:设计半开放微流控芯片，实现人骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stromal cells，BMSC）、人胚肺成纤维细胞（human fetal lung fibroblast 1，HFL1）与人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）共培养，建立三维器官芯片体系。设置HFL1与HUVEC不同比例与BMSC共培养，分为对照组（HFL1∶HUVEC=1∶1）、纤维化组（HFL1∶HUVEC=3∶1）与血管化组（HFL1∶HUVEC=1∶3）。通过碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、茜素红（alizarin red）染色观察BMSC成骨分化情况，qPCR分析成骨标志基因 SP7、 RUNX2、 ALPL、 BGLAP及血管化相关基因 KDR、 VWF转录情况，Western blot检测成骨标志蛋白RUNX2和ALP表达水平。 结果:BMSC、HFL1和HUVEC共培养体系中BMSC正常生长且出现明显生物矿化行为，血管内皮细胞能够形成有序血管结构，证实体系构建成功。相较对照组，纤维化组BMSC成骨分化下降趋势不明显，矿化标志基因 ALPL和 BGLAP相对表达量为0.55±0.19、0.42±0.27，差异均有统计学意义（ P<0.05）；血管化组基因 KDR和 VWF下调，相对表达量为0.49±0.17、0.49±0.21，差异均有统计学意义（ P<0.05）。相较对照组，血管化组BMSC成骨分化基因 SP7、 RUNX2、 ALPL和 BGLAP上调，相对表达量分别为2.91±0.52、3.83±1.87、3.22±1.29和5.21±1.46，差异均有统计学意义（ P<0.05）；血管化基因 KDR、 VWF上调，相对表达为8.24±2.84、5.32±1.67，差异均有统计学意义（ P<0.05）。Western blot结果表明RUNX2、ALP在血管化组中表达增加，纤维化组中表达减少。 结论:骨不连类器官芯片能够部分模拟骨不连局部微环境，纤维化可能导致骨形成能力和血管化水平显著下降，是无菌性骨不连发生的潜在重要原因。

目的 探讨反复低血糖患者血糖管理行为的退化过程及主要特征.方法 采用聚敛式设计的混合方法研究.采用方便抽样法,选取2022年6月—2023年4月在江苏省常熟市某三级甲等中医医院内分泌科就诊的382例反复低血糖患者进行问卷调查,并对其血糖管理行为进行K-均值聚类分析;同期,采用方便抽样法和目的抽样法,以最大差异化为原则,选取19例患者进行半结构式访谈.结果 量性研究结果:反复低血糖患者血糖管理损耗得分为(49.20±6.58)分,认知控制、行为控制和情绪控制维度得分分别为(17.90±4.12)、(15.49±3.64)和(15.81±3.58)分;聚类分析将血糖管理行为退化特征分为认知损耗组、情绪损耗组和自我控制组.质性研究结果:反复低血糖患者血糖管理退化过程包括3个主题,即行为损耗前因、行为损耗过程和行为损耗后效.混合研究结果:在血糖管理进程中,患者更关注即时效果,忽略管理行为长期维持的重要作用,呈现非理性的决策行为;退化行为特征可分为3组,其血糖管理各行为退化特征不同.结论 反复低血糖患者的血糖管理退化行为较严重,是多种因素联合作用、持续消耗自我控制能量的结果.可从知识、情绪和行为层面着手,帮助患者明晰可能的血糖发展趋势,提高对血糖管理价值的理解和认同,从而推动管理行为的长期维持.

目的:本研究旨在通过证据图的方法,整理针刺治疗慢性阻塞性肺疾病的临床研究,探讨慢性阻塞性肺疾病的现状.方法:计算机检索中国知网(CNKI)、万方数据知识服务平台(WanFang Data)、维普中文期刊服务平台(VIP)、中国生物医学文献服务系统(CBM)、PubMed、Cochrane Library、EMBASE、Ovid web数据库中针灸治疗慢性阻塞性肺疾病文献,检索时间为建库至2022年3月2日.分析方法质量学评价、研究总体趋势、样本量、干预措施设计、疗效评价指标.方法学质量评价采用AMSTAR-2工具,并对纳入的干预性研究以图表和文字结合的形式总结证据特点.结果:共纳入干预性研究637篇,系统评价20篇.研究总体成上升趋势且近年有所增长;研究干预措施单一疗法为371篇(58％)占多半,又以穴位贴敷203篇(55％)居多,双臂试验为主;肺功能检查、有效率、急性加重次数是现有针灸治疗COPD临床研究关注较多的结局指标,同时高质量的系统评价较少.结论:针灸治疗COPD具有优势性.干预措施和疗效评价指标具有多样性,但合理性需要优化,结局指标尚需优化选择;今后需进一步扩大研究以及提高相关系统评价/Meta分析的方法学质量,完善研究设计和研究方案,为证据使用者和相关领域研究的进一步优化提供证据支撑.

目的:获得靶向瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)通道的多肽抑制剂.方法:基于已有的靶向TRPV1通道的多肽激动剂红头蜈蚣毒素(RhTx)进行理性设计,在其氨基末端增加带正电荷的氨基酸,并在细胞上使用膜片钳电生理验证设计的多肽对TRPV1通道的抑制作用.结果:理性设计了8条Nplus-RhTx多肽,在膜片钳电生理记录中发现其中4条可以抑制TRPV1的辣椒素激活,4条Nplus-RhTx多肽的半数有效抑制浓度分别为(188.3±4.7)、(193.6±18.0)、(282.8±11.9)和(299.5±6.4)μmol/L.结论:通过对RhTx多肽的氨基端进行理性设计改变其性质,可获得靶向TRPV1的多肽抑制剂.

聚羟基脂肪酸酯解聚酶(polyhydroxyalkanoate depolymerase,PHAD)可用于聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)的降解回收,为开发热稳定性好的 PHAD,本研究在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达了来自短须嗜热单孢菌(Thermomonospora umbrina)的PHA解聚酶(TumPHAD),并通过二硫键理性设计获得了热稳定性提升的突变体A190C/V240C,其最适温度为 60℃,比野生型提高 20℃,50℃半衰期为 7 h,是野生型酶的 21 倍.将突变体A190C/V240C用于典型PHA之一的聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)降解,在 50℃条件下,PHB的 2 h和 12 h降解率较野生型分别提高了 2.1 倍和 3.8 倍.本研究获得的TumPHAD突变体A190C/V240C具有耐高温、热稳定性好和PHB降解能力强的特点,对PHB的降解回收具有重要意义.

ω-转氨酶(ω-transaminase,ω-TA)作为一种天然的生物催化剂,在手性胺类化合物的合成中具有较好的应用前景.但ω-TA在催化非天然底物的反应过程中存在稳定性差、活性低的缺陷,大大限制了 ω-TA 的应用.为改善此缺陷,针对来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的(R)-ω-TA(At TA),采用基于分子动力学模拟的计算机辅助设计与随机突变、组合突变相结合的策略进行酶的热稳定性改造,获得了热稳定性与活性同步提高的最佳突变酶At TA-E104D/A246V/R266Q(M3).与At TA野生酶(wild-type,WT)相比,M3 的半衰期t1/2(35℃)由 17.8 min提升至 102.7 min,提升了 4.8 倍,半失活温度T1050 比WT(38.1℃)提高 2.2℃.最佳突变酶M3 对丙酮酸和 1-(R)-苯乙胺的催化效率分别是野生酶的 1.59 倍和 1.56 倍.分子动力学模拟与分子对接结果表明,分子内氢键与疏水相互作用的增加所导致 α-螺旋的加固稳定是酶热稳定性提升的主要原因;底物分子与结合口袋氨基酸之间氢键相互作用的增加以及底物结合口袋体积的增大是导致 M3 催化效率提升的主要原因.底物谱测定结果表明,相较于 WT,M3 对 11 种芳香酮类化合物的催化性能均有所提升,进一步说明M3 对手性胺的合成具有更高的应用价值.

甘油二酯(diacylglycerol,DAG)是油脂代谢的中间产物,在人体中具有重要的生理功能,主要通过脂肪酶水解油脂制备.但对 1,2-甘油二酯(1,2-diacylglycerol,1,2-DAG)、1,3-甘油二酯(1,3-diacylglycerol,1,3-DAG)的检测分离方法及脂肪酶的催化特异性的研究较少,限制了其广泛应用.基于以上问题,本研究首先通过超临界流体色谱与蒸发光散射检测器联用,优化检测分析参数,建立了 1,2-DAG(0.025?0.200 g/L)和 1,3-DAG(0.025?0.150 g/L)的高效定量检测方法.进一步基于疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)与三油酸甘油酯的分子对接,挑选了 5 个潜在底物结合位点并通过定点饱和突变构建了突变体库,利用超临界流体色谱方法对突变体催化特异性进行筛选.突变文库中I202V表现出最高的 1,3-位置选择特异性,较野生型TLL提高了 11.7%.本文基于半理性设计方法实现了对TLL位置催化特异性的改造,并建立了一种能够高效分离检测DAG位置异构体的方法,为脂肪酶催化特异性研究提供了参考.

玉米赤霉烯酮是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌(Fusarium)毒素,严重危害牲畜以及人类的健康.来源于粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)的玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase,ZHD)能有效降解饲料中的玉米赤霉烯酮,然而饲料加工中的高温环境限制了该酶的应用.基于结构特征的理性设计可为酶的热稳定性改造提供指导.本研究首先基于蛋白质结构比对(multiple structure alignment,MSTA)筛选ZHD的结构灵活区,随后基于序列保守性打分以及构象自由能计算设计突变文库,得到基于 136 号和 220 号残基的 9 个单点突变设计.结果表明,9 个突变体的热熔融温度(Tm)提高了 0.4?5.6℃,其中S220R和S220W热稳定性表现最好,Tm分别提高了5.6℃和 4.0℃,45℃下的热半失活时间分别延长了 15.4 倍和 3.1 倍,相对酶活分别为野生型的70.6%和 57.3%.分子动力学模拟分析表明突变位点及附近区域的作用力得到了增强,突变体S220R和S220W的220-K130氢键成键概率分别增加了37.1%和19.3%、K130-D223盐桥成键概率分别增加了 30.1%和 12.5%,为ZHD热稳定性的提高作出了贡献.这项工作表明结合天然酶的结构比对、序列分析及自由能计算的热稳定性改造策略的可行性,并获得了热稳定性增强的 ZHD变体,为ZHD在工业上的应用打下基础.

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)是一种重要的辅助因子,参与许多需能的生物催化反应.多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinases,PPK)由于其底物聚磷酸盐廉价易得,可以为消耗ATP 的反应提供能量.本研究选择哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)来源的ChPPK,进行了底物谱和耐受性分析,通过分子对接和定点突变,理性改造多聚磷酸盐激酶的双底物通道腔来提高PPK酶的催化活性.与野生型相比,筛选得到突变体ChPPKK81H-K103V的相对酶活提高了326.7%,同时,双突变扩大了ChPPK的底物利用范围与耐受性,提高了该酶的耐热性与耐碱性.基于该ATP再生系统,本研究偶联谷胱甘肽双功能酶GshAB和ChPPKK81H-K103V,破细胞后采用无细胞催化生产谷胱甘肽,加入5 mmol/L ATP后,该体系6 h可以生产(25.4±1.9)mmol/L的谷胱甘肽,比突变前的催化体系提高了 41.9%.优化无细胞催化体系的缓冲液、裂解液菌体量、补料时间后,无细胞体系可产生(45.2±1.8)mmol/L谷胱甘肽,底物 L-半胱氨酸的转化率达到 90.4%.提高ChPPK生产ATP 的能力,可有效增强底物的转化率,降低催化成本,实现了无细胞催化生产谷胱甘肽的高产量、高转化率与高经济价值的统一.本研究提供了一种绿色高效的 ATP 再生系统,可为消耗 ATP的生物催化反应平台提供可持续动力.