[背景]作为降解木聚糖的核心酶种,木聚糖酶可以有效促进木质纤维素的消化水解,在动物养殖领域应用广泛.来源于嗜热细菌贝斯其热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii)的GH10 家族木聚糖酶CbXyn10C最适温度为 85℃,在 80℃条件下具有良好的热稳定性,具有饲料工业应用潜力.[目的]为满足饲料制粒尤其是水产饲料加工过程的工艺要求,进一步提高木聚糖酶CbXyn10C的热稳定性并阐明其耐热机理.[方法]以CbXyn10C晶体结构为基础,采用刚性氨基酸引入、疏水作用网络重排 2 种策略对其热稳定性进行理性设计,获得在 100℃条件下比活提高的单点突变体后,通过有益突变位点叠加策略进一步提升酶的热稳定性,最后采用分子动力学模拟技术分析其热稳定性提高的分子机制.[结果]共获得了 4 个稳定性提高的单点突变体A45P、T69P、F309V和A325P,其中突变体A45P效果最优.随着在A45P基础上另外 3 个突变位点的叠加,酶的热稳定性在不损失酶活的前提下得到了逐步提升.获得的四点突变体A45P/F309V/A325P/T69P的耐热性最好,其最适反应温度和熔解温度Tm值较野生型分别提高了 5℃和 6.8℃.分子动力学模拟技术分析发现 4 个位点的突变引入了新的氢键作用力且优化了疏水作用网络,进而导致酶的结构构象更加稳定.[结论]本研究不仅提高了木聚糖酶在饲料工业中的应用价值,而且对基于酶蛋白结构的稳定性分子改造提供了理论支持.

(S)-2-氨基丁醇同时具有羟基及氨基官能团,是多种重要药物分子的关键手性中间体,生物合成(S)-2-氨基丁醇尚缺少有效的酶元件.以塞格尼氏菌(Segniliparus rugosus)来源的羧酸还原酶SrCAR为研究对象,通过对实验室已有SrCAR突变文库进行筛选测试,结合活性位点共进化分析,同时利用组合活性中心饱和突变策略(Combi-natorial active-site saturation test,CAST)构建新的突变体文库,经测试最终获得优势突变体XH7(G430V/E533F/A627N).该突变体催化底物N-Boc-(S)-2-氨基丁酸到醛产物的活性(keat/Km)较野生型SrCAR提高2.1倍,热熔值(Tm)提升2.3℃.进一步通过引入荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)来源的醇脱氢酶PfADH,可还原N-Boc-(S)-2-氨基丁醛到醇产物.XH7和PfADH的双酶共表达体系反应5 h即可将20 mmol/L底物实现几乎完全转化,转化率达到99％,并经脱Boc保护与分离纯化获得终产物(S)-2-氨基丁醇,得率为60％.通过分子动力学模拟解析最优突变体活性及热稳定性提高的分子机制,为SrCAR酶设计改造提供新的研究思路,拓展酶法合成(S)-2氨基丁醇的生物酶工具箱,可为类似高附加值医药中间体的生物合成提供理论和实践指导.

聚羟基脂肪酸酯解聚酶(polyhydroxyalkanoate depolymerase,PHAD)可用于聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)的降解回收,为开发热稳定性好的 PHAD,本研究在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中成功表达了来自短须嗜热单孢菌(Thermomonospora umbrina)的PHA解聚酶(TumPHAD),并通过二硫键理性设计获得了热稳定性提升的突变体A190C/V240C,其最适温度为 60℃,比野生型提高 20℃,50℃半衰期为 7 h,是野生型酶的 21 倍.将突变体A190C/V240C用于典型PHA之一的聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)降解,在 50℃条件下,PHB的 2 h和 12 h降解率较野生型分别提高了 2.1 倍和 3.8 倍.本研究获得的TumPHAD突变体A190C/V240C具有耐高温、热稳定性好和PHB降解能力强的特点,对PHB的降解回收具有重要意义.

ω-转氨酶(ω-transaminase,ω-TA)作为一种天然的生物催化剂,在手性胺类化合物的合成中具有较好的应用前景.但ω-TA在催化非天然底物的反应过程中存在稳定性差、活性低的缺陷,大大限制了 ω-TA 的应用.为改善此缺陷,针对来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的(R)-ω-TA(At TA),采用基于分子动力学模拟的计算机辅助设计与随机突变、组合突变相结合的策略进行酶的热稳定性改造,获得了热稳定性与活性同步提高的最佳突变酶At TA-E104D/A246V/R266Q(M3).与At TA野生酶(wild-type,WT)相比,M3 的半衰期t1/2(35℃)由 17.8 min提升至 102.7 min,提升了 4.8 倍,半失活温度T1050 比WT(38.1℃)提高 2.2℃.最佳突变酶M3 对丙酮酸和 1-(R)-苯乙胺的催化效率分别是野生酶的 1.59 倍和 1.56 倍.分子动力学模拟与分子对接结果表明,分子内氢键与疏水相互作用的增加所导致 α-螺旋的加固稳定是酶热稳定性提升的主要原因;底物分子与结合口袋氨基酸之间氢键相互作用的增加以及底物结合口袋体积的增大是导致 M3 催化效率提升的主要原因.底物谱测定结果表明,相较于 WT,M3 对 11 种芳香酮类化合物的催化性能均有所提升,进一步说明M3 对手性胺的合成具有更高的应用价值.

玉米赤霉烯酮是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌(Fusarium)毒素,严重危害牲畜以及人类的健康.来源于粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)的玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase,ZHD)能有效降解饲料中的玉米赤霉烯酮,然而饲料加工中的高温环境限制了该酶的应用.基于结构特征的理性设计可为酶的热稳定性改造提供指导.本研究首先基于蛋白质结构比对(multiple structure alignment,MSTA)筛选ZHD的结构灵活区,随后基于序列保守性打分以及构象自由能计算设计突变文库,得到基于 136 号和 220 号残基的 9 个单点突变设计.结果表明,9 个突变体的热熔融温度(Tm)提高了 0.4?5.6℃,其中S220R和S220W热稳定性表现最好,Tm分别提高了5.6℃和 4.0℃,45℃下的热半失活时间分别延长了 15.4 倍和 3.1 倍,相对酶活分别为野生型的70.6%和 57.3%.分子动力学模拟分析表明突变位点及附近区域的作用力得到了增强,突变体S220R和S220W的220-K130氢键成键概率分别增加了37.1%和19.3%、K130-D223盐桥成键概率分别增加了 30.1%和 12.5%,为ZHD热稳定性的提高作出了贡献.这项工作表明结合天然酶的结构比对、序列分析及自由能计算的热稳定性改造策略的可行性,并获得了热稳定性增强的 ZHD变体,为ZHD在工业上的应用打下基础.

磷是有限不可再生资源,土壤缺磷是植物生长和农作物生产的主要限制因子之一.无机磷肥施入土壤后,极易被土壤固相吸附或与金属阳离子形成难溶性络合物或转化为有机磷,导致其生物可利用性降低.土壤磷主要以有机磷形式存在,占比 20%-80%.有机磷又以植酸(盐)为主要成分,占比约 50%.植酸不可被植物直接吸收利用,需在专一性酶植酸酶作用下经脱磷酸化水解释放磷供植物吸收.土壤植酸酶主要来源于微生物,易受温度、pH、土壤吸附、钙含量及钙磷比、底物含量和有效性等影响,导致酶活降低甚至失活.如何保持或提高土壤中植酸酶活性,进而提高土壤内源植酸磷的利用率,对降低外源磷肥施加和保障农业生产具有重要意义.本文综述微生物植酸酶的来源、分类与作用机制及土壤中植酸酶活性的影响因素,重点阐述保持或提高其活性的方法及实际应用效率.针对土壤植酸酶活性低和稳定性差的问题,对通过调控最适pH范围、提高热稳定性、将植酸酶负载于纳米材料和基因工程改造等改善植酸酶性质的方法进行展望.综述内容可为理解土壤中植酸酶活性的影响因素,进而提高土壤内源植酸磷的利用效率提供理论依据和技术参考,对减少外源磷肥施用、降低磷流失和土壤面源/水体污染风险及保障农业可持续发展具有一定的现实意义.

β-丙氨酸是多个药物合成的重要砌块,可以通过天冬氨酸α脱羧酶(PanD)催化L-天冬氨酸脱羧来合成,但普遍在用的PanD酶活性不高是制约全细胞催化合成β-丙氨酸的瓶颈.因此,本研究通过酶的挖掘,选择将杰氏棒杆菌来源(Corynebacterium jeikeium)PanD在Escherichia coli中异源表达.对杰氏棒杆菌来源PanD进行AlaphFold2 建模和分子对接,采用Rosetta虚拟突变确定突变热点,结合薄层层析初筛和纯化后复筛,最终筛选到突变体L39A,其比酶活为 13.45 U/mg,相比野生型酶的比酶活(9.6 U/mg)提升了 1.4 倍.酶学性质表征数据表明,野生型酶和L39A突变体最适pH均为 6.5,且在pH 6.0-7.0 之间酶活性稳定;两者最适温度为 55℃,但L39A热稳定性较野生型提高;突变体酶的催化效率比野生型提升了 1.4 倍.对突变体进行结构解析发现,39 位取代为侧链基团更小的丙氨酸,亲水性增强,增加了关键催化氨基酸 58 位酪氨酸与其他氨基酸的相互作用,使活性中心周围的区域稳定性提高,从而提高了催化活性.全细胞催化数据表明,在OD600=40 的菌体浓度下,L39A在 4 h能够转化 70%的L-天冬氨酸,而野生型 4 h仅能转化约 50%,L39A在 10 h能够转化 90%L-天冬氨酸,在 12 h能够完全转化 1 mol/L的L-天冬氨酸,这种全细胞转化效率的提升在 1.5 mol/L的底物条件下更加明显.本研究筛选到的突变体具有工业化应用潜力,建立了绿色、高效的β-丙氨酸生物合成法,为生物法大规模合成β-丙氨酸提供了重要的技术基础.

木聚糖是植物细胞中含量最高的半纤维素,是一种重要的微生物资源,也是自然界中含量丰富的多糖之一.木聚糖酶是能够将复杂的木聚糖结构水解为木寡糖的一类酶系,按其结构域可分为不同的家族,其中大部分木聚糖酶属于糖苷水解酶的10和11家族,而11家族的木聚糖酶由于分子量较小,比酶活较高等诸多优点使其在饲料、造纸、食品、能源工业有着广阔的应用前景.但是商业化木聚糖酶必须易于生产,酶活较高,并且能够适应工业过程中的各种严格条件,例如饲料与造纸工业过程中有时需要瞬时提高反应温度,这就要求参与这一系列反应的木聚糖酶在高温下有着较高的比酶活和热稳定性.但是一般条件下,很多微生物分泌的木聚糖酶达不到此要求,因此,通过合理的分子生物学方法提高木聚糖酶的热稳定性使其在工业生产中发挥更大的作用是人们不断追求的目标.本文重点阐述二硫键、糖基化、疏水作用等蛋白的重要性质,结合作者自身实验结果,讨论了这些性质对11家族木聚糖酶热稳定性的影响.为进一步加深木聚糖酶作用机制的了解、指导木聚糖酶的分子改良有提供参考.

纤维素水解成为葡萄糖需要一系列纤维素酶的作用,其中β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases)起着至关重要的作用.来自于培菌白蚁中肠的β-葡萄糖苷酶(MbmgBGl)具有较高的葡萄糖耐受性(1.5 mol/L的葡萄糖,保持60％以上的酶活力),但是,酶活力低和热稳定性差限制了β-葡萄糖苷酶(MbmgBGl)在食品以及工业领域中的应用.因此通过对保守氨基酸附近的非保守氨基酸定点突变,获得点突变体(F167L、T176C、E347I、R354K、N393G和V425M),其中突变体F167L、R354K的比活力(底物pNPG)比MbmgBG1分别高出约2倍和4倍.突变体的Kcat/Km值比野生型大,反映了突变体对底物的亲和力以及催化能力比MbmgBG1强.当酶活力保留60％以上时,MbmgBG1所耐受的葡萄糖浓度为1.5 mol/L,而F167L为2.0 mol/L,R354K为3.0 mol/L.这些特性的增强表明,对活性中心附近保守区域内的非保守氨基酸突变,可以较大程度地影响活性,因此需要更深入地研究β-葡萄糖苷酶的活性中心位点,进行改造以提高催化效率.

[目的]探索V1C、G116D、N171H定点突变对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的作用.[方法]生物信息学方法确定木聚糖酶XynZF-2可突变位点,引入Cys、Asp、His;定点突变V1C、G116D、N171H,PCR扩增突变基因xynCDH,构建大肠杆菌表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达目的蛋白并测定酶活,分析酶学性质.[结果]突变酶XynCDH的最适温度由40℃上升到45℃.40℃条件下突变酶XynCDH半衰期t1/240℃由55 min延长到60 min;在45℃条件下,突变酶XynCDH的半衰期t1/245℃由7min提高到15 min.[结论]定点突变V1C、G116D、N171H能增强木聚糖酶XynZF-2热稳定性,为加深木聚糖酶分子改造的研究提供参考.