重楼药材的供不应求促进了对其基原植物地上部分废弃资源的综合利用与开发研究.前期基于液质联用技术明确了华重楼地上部分的化学组成,并从中分离得到一系列黄酮和甾体皂苷类成分,该研究继续针对基于液质联用技术发现的潜在新化合物进行分离和结构鉴定研究.采用硅胶、ODS、Flash快速制备等柱色谱技术,结合制备高效液相色谱,从华重楼地上部分 75%乙醇提取物分离得到 5 个化合物,通过波谱数据结合化学转化的方法鉴定了 5 个化合物的结构,分别为(23S,25R)-23α,27-二羟基薯蓣皂苷元-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、(25R)-26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-呋甾-5-烯-3β,22α,26-三醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、(25R)-27-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5-烯-3β,27-二羟基螺甾-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(3)、(25R)-27-O-β-D-吡喃葡萄糖基-5-烯-3β,27-二羟基螺甾-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[(β-D-吡喃葡萄糖基-(1→3)]-β-D-吡喃葡萄糖苷(4)和aculeatiside A(5),其中化合物 1～4 为新化合物,化合物 5 为首次从本植物中分离得到.

目的:明确华重楼皂苷类成分与生态因子的相关性.方法:利用HPLC测定了不同华重楼样品中重楼皂苷的含量;利用数字高程模型和ArcGIS软件提取生态因子数据(年平均气温,海拔,相对湿度,年日照时数,年降水量,7月最高气温,7月平均气温,1月最低气温和1月平均气温);应用主成分分析方法确定了偏诺皂苷-3-O-β-D-glu(1 →3)[α-L-rha(1→2)]-β-D-glu(PGGR),重楼皂苷Ⅶ,H,I和V是华重楼的主要有效成分;采用回归分析法分析了这些生态因子与重楼药材皂苷类化学成分之间的相关性和变量投影重要性,应用SPSS 22.0偏最小二乘回归方法建立了回归方程.结果:青川、洪雅、巴中的重楼皂苷I,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ的总量达到了2015年版《中国药典》重楼项下0.6％的最低限量标准,认为这几个产地华重楼品质较优;生态因子中日照时数,7月最高气温,7月平均温度与重楼皂苷Ⅶ和PGGR呈负相关关系,1月最低气温和1月平均气温与重楼皂苷Ⅶ和PGGR呈正相关关系.日照时数,7月最高气温,7月平均气温与重楼皂苷H,I和V呈正相关关系,海拔高度,相对湿度,年均降水量,1月平均气温与重楼皂苷H,I和V呈负相关关系.结论:明确了华重楼化学成分与气象因子之间的相关性,为培育质优、高产的华重楼提供理论基础,同时为华重楼的规范化生产提供理论支持.

华重楼药材供应不足问题已严重制约下游产业的可持续发展.选育高产品种是生产上扩大华重楼药材供给的重要途径.合理株型是作物高产品种的生育基础和形态特征,也是品种选育的重要方向.该研究对99份华重楼野生种质资源的主要植物形态特征和根茎干重及其重楼皂苷含量进行考察分析,结果表明:①华重楼野生种质资源存在广泛的形态变异,变异幅度由高到低依次为皂苷含量、根茎干重、叶柄长、茎长、花瓣长、花梗长、萼片长、叶宽、叶长、萼片宽、叶片数、雄蕊数、花瓣数;②华重楼各形态性状之间存在较强的相关性,主成分分析显示其大体上综合反映了华重楼的光合部位发育和生殖部位发育特征;③重楼皂苷Ⅶ,Ⅵ,Ⅱ,Ⅰ总量介于0.02％～0.87％,平均0.13％,与其他各农艺性状无显著相关性.④华重楼高产选育应当重视具有大叶片、大萼片、高茎秆特征的种质资源的利用.

目的:基于DNA条形码技术鉴定重楼栽培品的基原,并比较同物种重楼栽培品与野生品的DNA条形码差异.方法:通过聚合酶链式反应(PCR)对重楼的ITS和ITS2序列进行扩增;通过与GenBank数据库进行Blast比对,确定收集重楼样品的物种;利用距离法和建树法比较重楼样品种内和种间的亲缘关系;比较不同物种样品之间,以及同物种样品的野生品与栽培品之间的碱基差异.结果:收集重楼样品经Blast比对共有10个物种,分别为宽瓣重楼、毛重楼、七叶一枝花、花叶重楼、独龙重楼、五指莲重楼、西藏延龄草、平伐重楼、华重楼、南重楼;除南重楼的ITS序列与毛重楼的平均种间遗传距离小于南重楼的最大种内遗传距离外,各个物种的ITS和ITS2序列的最大种内遗传距离均小于其最小种间平均遗传距离,通过建立NJ树聚类分析,重楼样品的10个物种中相同物种聚类,且具有良好的单系性;从碱基比较结果上看,野生重楼样品与栽培重楼样品的碱基差异很小,甚至完全一致.结论:市场流通重楼药材的性状多样且差异很大并非由于人工驯化造成,而是由于重楼栽培基原的混乱造成的,且多数流通样品为非《中华人民共和国药典》收载物种,通过DNA条形码技术为重楼属药用植物鉴别开辟了一条新途径.

目的 研究华重楼[Paris polyphylla Smith var.chinensis (Franch.) Hara]地上部分的化学成分.方法 利用HPD100大孔吸附树脂柱色谱、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱及半制备型高效液相色谱等多种方法对华重楼地上部分体积分数75％乙醇提取物进行分离纯化,通过光谱数据鉴定化合物结构.结果 从华重楼地上部分分离得到11个化合物,分别鉴定为:corchionoside C (1),β-蜕皮甾酮 (2),coronatasterone (3),山柰酚3-O-β-D-吡喃半乳糖苷 (4),紫云英苷 (5),异鼠李素3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 (6),山柰酚3-O-β-D-吡喃葡萄糖- (l→2) -β-D-吡喃半乳糖苷 (7),异鼠李素3-O-β-D-吡喃葡萄糖- (l→2) -β-D-吡喃半乳糖苷 (8),山柰酚3-O-β-D-吡喃葡萄糖- (1→2) -β-D-吡喃葡萄糖苷 (9),异鼠李素3-O-β-D-吡喃半乳糖- (l→6) -β-D-吡喃葡萄糖苷 (10) 和异鼠李素-3-O-龙胆双糖苷 (11).结论 化合物1,3～11为首次从该植物中分离得到,化合物1,3～5和8～10为首次从该属植物中分离得到.

目的 挖掘具有药用价值的优异重楼属植物资源,缓解药用重楼资源压力,为促进重楼的可持续利用提供材料基础.方法 在四川盆周山地采集21份重楼资源,根据表型筛选出大块茎资源GQ与MH,多芽资源GK.初步形态鉴定后,利用DNA条形码ITS、psbA-trnH序列,采用Kimura双参数模型构建ML系统聚类树,进行系统发育分析.采用H-PLC法检测其主要活性成分皂苷的含量,以预测其潜在药用价值.结果 形态学结合分子鉴定结果表明,GQ、GK和MH分别依次为华重楼、滇重楼和长柱重楼.GQ、GK、MH和对照滇重楼(CK)的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量及其比例表现各异,其中总含量表现为GQ＞MH＞CK＞GK,重楼皂苷I在GQ和MH中占比较高,分别较CK高出67.61％和73.25％,而重楼皂苷Ⅶ在GK中占比最高,表现为56.38％.结论 GQ、GK和MH分别为产于四川盆周山地特定居群的华重楼、滇重楼和长柱重楼,引种至成都平原后性状表现优良,为后续的重楼的育种研究提供了材料基础;同时3个资源均具药用潜力,其中长柱重楼MH居群资源的重楼皂苷I及重楼皂苷总含量较高,为滇重楼、华重楼替代药材的筛选提供了新选择.

目的:分离和鉴定出四川华重楼种植区域发生的一种新病害病原菌,并进行室内防治药剂筛选,为该病害的田间防治提供理论依据.方法:通过带病组织分离获得病原菌,并对病原菌进行致病性测定、形态学和分子生物学分析,同时进行了7种杀菌剂对病原菌的室内毒力测定试验.结果:试验结合病原菌的形态特征以及rDNA-ITS、RBP2、G3PDH和HSP60基因序列分析,并构建多基因分子系统发育树,鉴定出引起华重楼新病害的病原菌为葡萄孢属灰葡萄菌Botrytis cinerea Pers.ex Fr.;室内毒力测定结果显示,80％乙蒜素乳油1 500倍液的抑菌效果最好.抑制率高达90.1％;其次是2％春雷霉素水剂1 000倍液和3％中生菌素可湿性粉剂1 000倍液,抑制率分别为84.8％和80.2％,其余药剂对菌丝的抑制率均低于80％.结论:引起华重楼新病害的病原菌为葡萄孢属灰葡萄菌Botrytis cinerea Pers.ex Fr.,同时.乙蒜素是防治葡萄孢属灰葡萄菌菌丝生长的最佳药剂.

目的 研究不同梯度水平氮、磷、钾肥对华重楼根茎的产量和品质的影响,确定华重楼植物的最适施肥方案,为合理施肥提供科学依据.方法 采用3因素5水平2次通用旋转组合设计进行田间试验,研究氮、磷、钾肥配施对华重楼根茎的产量总皂苷含量、灰分、水分和浸出物的影响.结果 建立的回归方程均达到显著水平;当施用氮肥41.66～52.60 kg/hm2、磷肥181.38～244.38 kg/hm2、钾肥24.16～35.20 kg/hm2时,华重楼根茎的增重率大于81.72％;当施用氮肥45.48～53.83kg/hm2、磷肥179.98～236.83 kg/hm2、钾肥29.80～39.95 kg/hm2时,华重楼根茎的总皂苷含量大于11.09％;当施用氮肥28.01～37.79 kg/hm2、磷肥127.18～209.18 kg/hm2、钾肥25.27～34.09 kg/hm2时,华重楼根茎的浸出物含量大于14.31％.结论 氮、磷、钾肥配施有利于华重楼根茎的增重率、总皂苷含量和浸出物含量的提高,华重楼植物的最佳施肥量为氮肥37.79～45.48kg/hm2、磷肥181.38～209.18 kg/hm2、钾肥29.80～34.09 kg/hm2.

为探究华重楼种子休眠解除过程中差异基因的表达情况及相关代谢通路,以华重楼休眠解除前后种胚为材料,利用新一代高通量测序手段对供试样品进行转录组测序并进行系统生物信息学分析.从cDNA文库中分别获得62 882 650,62 263 366个clean reads,共得到69 248个差异表达基因,上调的表达基因有56 426个,下调的表达基因有12 822个.共有138 267个差异表达基因被GO功能注释到生物进程、分子功能和细胞组分3个大类58个亚类,注释的差异表达基因与代谢过程、生物调控、细胞组分合成和酶催化活性等密切相关.对58 722个差异表达基因进行pathway显著性富集分析,共发现139个代谢通路,休眠前后的DEGs主要富集在碳代谢、次生代谢产物生物合成和多糖代谢等途径.基于KEGG数据库中注释结果,共发现16条与华重楼休眠解除相关的代谢通路.华重楼种子发育与休眠解除过程中大量与种胚形态建成、多糖分解及蛋白质合成的差异基因参与表达,涉及到多个代谢途径的相互作用,构成复杂的休眠解除调控网络.

目的:鉴定引起四川地区华重楼焦斑病和圆纹病的病原菌.方法:采用组织分离法对病原菌进行分离,利用科赫氏法则验证其致病性,依据菌株的形态学和基于rDNA-ITS、TEF和Tub2基因序列分析对病原菌进行鉴定.结果:华重楼焦斑病病原菌的ITS-Tub2基因序列与已登录的Leptosphaerulina australis(登录号分别为MH861604、GU237540)聚类在一个分支上,支持率为100％;圆纹病病原菌的ITS-TEF基因序列与已登录的Clonostachys rosea(登录号分别为KC806254、KX 184997)的同源性为100％.结论:根据病原菌的形态学和分子生物学,将引起华重楼焦斑病病原菌鉴定为小米壳属真菌Leptosphaerulina australis,圆纹病病原菌鉴定为链孢粘帚霉属真菌Clonostachys rosea.