目的:观察人脂肪干细胞(hASCs)与人表皮生长因子(hEGF)对皮肤缺损创面修复的影响。方法:选择郑州大学第二附属医院2020年1月6例患者抽脂减肥的脂肪组织作为hASCs的来源，以酶消化法从人脂肪组织中提取hASCs，将其培养至第3代。利用倒置显微镜对细胞形态进行观察；使用流式细胞仪鉴定细胞表型及分化能力检测。随机将24只新西兰大白兔建立背部全层皮肤缺损模型，并将实验用新西兰大白兔随机分为3组，设立实验组(hASCs+hEGF组)，细胞治疗对照组(hASCs组)和空白对照组[磷酸盐缓冲液(PBS)组]。实验组予以100 μl PBS重悬第3代脂肪来源干细胞(1×10 6个)，以10 μg/L加入人表皮细胞生长因子；细胞治疗对照组予以100 μl PBS重悬第3代脂肪来源干细胞(1×10 6个)；空白对照组取PBS，各组均注射600 μl局部移植至创面边缘及基底部。大体观察创面愈合情况，计算创面面积占初始创面面积百分比；创面组织进行标本苏木精-伊红(HE)染色，免疫组织化学CD31染色检测等方法观察和比较各组创面愈合水平。多样本均数比较采用方差分析，采用 t检验对比组间计量资料。 结果:相差显微镜观察hASCs的细胞形态学特征：可见原代脂肪间充质干细胞(ADSCs)呈梭形，接种后2 h后开始圆形，大部分细胞变形在48 h后，细胞形态以长梭形为主，短梭形、狭长形及多角形较少，胞质丰富，胞核清楚，并分泌大量基质，基质内呈特异性深蓝色，第3代时可见细胞以长梭形为主，漩涡状生长。应用流式细胞仪检测显示CD90、CD105、CD73呈阳性表达，阳性率在95%以上，CD34、CD11b、CD19、CD45及HLADR呈阴性表达；人脂肪源性干细胞(hADSCs)在加入成脂诱导液培养后，hADSCs可向脂肪细胞分化，加入成软骨诱导培养基诱导后，hADSCs可向软骨细胞分化。表明提取培养的细胞为hADSCs。实验组创面完全愈合，被覆盖新生的上皮组织，接近正常皮肤；细胞治疗对照组创面有68%愈合，新生上皮组织较薄，易破裂出血，与实验组比较，愈合质量欠佳；空白对照组创面愈合质量差，愈合面积约41%。创面面积占初始创面面积百分比3组比较，治疗后第7、11、14、18、21天时间点，实验组愈合速度最快，与细胞治疗对照组和空白对照组差异均有统计学意义( F＝21.095、115.094、199.695、204.917、600.699， P<0.05)，而细胞治疗对照组的愈合速度次之，且在7、11、14、18、21 d时间点与空白对照组比较差异有统计学意义( t＝13.064、13.187、14.315、16.177、14.238， P<0.05)。HE染色法行组织形态学观察实验组创面已经完全愈合，表皮修复情况良好，呈复层上皮排列，同时可见部分炎性细胞浸润；细胞治疗对照组则仍有部分创面未能愈合，肉芽组织以及创面表面仍可见较多的炎性细胞浸润；空白对照组则有相当一部分创面尚未愈合，存在较明显的炎性细胞浸润，且在尚未愈合的创口周围可见有瘢痕组织增生。CD31染色法观察新生微血管：实验组创面已经完全愈合，创面浅面可见新生血管，深部血管则呈垂直创面的方向生长，且血管密度较大；细胞治疗对照组则仍有部分创面未能愈合，肉芽组织生长良好，新生血管密度较为丰富，创面表面仍可见较多的炎性细胞浸润；空白对照组则有相当一部分创面尚未能愈合，炎性细胞浸润较明显，肉芽组织中新生血管数量较前两组有明显减少。 结论:hEGF可提高脂肪干细胞的存活率，并延长细胞的存活时间，从而增强hASCs促进创面愈合的作用。

目的:构建髓系细胞特异性Clcn7-G763R突变的骨硬化小鼠模型，并进行表型研究。方法:构建条件性敲入Clcn7基因p.G763R错义突变小鼠，并与溶菌酶M启动子-重组酶转基因小鼠(LysM cre)交配繁殖，最终获取髓系细胞特异性Clcn7-G763R突变的骨硬化小鼠。利用Micro CT分析不同基因型小鼠骨微细结构的差异，利用HE染色观察骨组织形态学改变。诱导原代破骨细胞，通过实时荧光定量PCR技术检测破骨细胞分化和成熟相关基因表达水平。利用骨吸收陷窝实验观察破骨细胞功能。结果:4周龄时纯合突变小鼠体重较野生型小鼠减轻[(12.000±1.666)g对(15.630±2.314)g， P＝0.021]，股骨长度较野生型缩短[(1.160±0.096)cm对(1.300±0.082)cm， P＝0.037)]。Micro CT发现纯合突变小鼠骨密度在4周龄时较野生型小鼠显著增加[(0.753±0.002)g/cm 3对(0.143±0.034)g/cm 2， P＝0.003]，而杂合突变小鼠骨密度在8周龄时增加明显[(0.236±0.021)g/cm 3对(0.180±0.020)g/cm 3， P＝0.030]。HE染色发现纯合突变小鼠骨髓腔消失，松质骨骨小梁数量显著增多，软骨肥大区增宽；杂合突变小鼠骨小梁较野生型小鼠增多。体外实验中，杂合突变小鼠破骨细胞数量较野生型无明显变化( P＝0.358)，但破骨细胞面积增大[(3.590×10 6±0.911×10 6)μm 2对(1.352×10 6±0.260×10 6)μm 2， P＝0.043]，骨吸收陷窝相关检测结果提示破骨细胞功能降低，而破骨细胞分化和成熟相关基因NFATc1、c-fos、Ctsk和Acp5表达水平均无显著变化。 结论:本研究成功构建髓系细胞特异性Clcn7-G763R突变的小鼠，突变型小鼠破骨细胞功能受损，骨量显著增加且股骨变短，为后续机制研究和治疗探索提供工具。

目的:从免疫细胞角度分析骨巨细胞瘤的免疫微环境，明确骨巨细胞瘤微环境的免疫细胞组成，在单细胞水平探索地舒单抗治疗前后骨巨细胞瘤的免疫改变。方法:自2018年11月至2020年5月收治的初发骨巨细胞瘤及地舒单抗治疗后骨巨细胞瘤的手术病例中收取新鲜组织样本，送质谱流式细胞术分析，使用t-distributed stochastic neighbor embedding（TSNE）降维分析将质谱流式高维数据可视化并定量，比较地舒单抗治疗前后骨巨细胞瘤的免疫细胞组成。选取部分未经地舒单抗治疗及经过地舒单抗治疗的组织进行原代体外培养并获得培养上清液，用于分析上清液对各类细胞系生长的影响。结果:共15例初发骨巨细胞瘤及3例地舒单抗治疗后骨巨细胞瘤经质检合格后完成质谱流式及多色流式分析，其中男7例，女11例。骨巨细胞瘤富含T细胞及多种巨噬细胞样表型的髓系细胞，经地舒单抗治疗后巨噬细胞样表型髓系细胞比例大幅度降低而T细胞比例上升，且巨噬细胞样表型髓系细胞比例与地舒单抗治疗时间相关。骨巨细胞瘤中疑似多核破骨样巨细胞的免疫细胞亚型以γδTCR+为特征，且表达多种趋化因子受体。肿瘤中的CD8+T细胞绝大多数为活化的PD-1 hiTIM-3+CD69+的T细胞。未经地舒单抗治疗直接手术的骨巨细胞瘤组织体外培养上清液能促进多种细胞系增殖，而地舒单抗治疗后肿瘤组织上清液则无该功能。 结论:绘制骨巨细胞瘤的免疫细胞谱图，探索骨巨细胞瘤内免疫细胞对肿瘤生长的潜在作用，为无法切除病例长时间使用地舒单抗提供了部分理论依据。

目的:观察原代成骨细胞来源胞外囊泡(OB-EV)对破骨细胞增殖、分化的作用,探究胞外囊泡参与成骨细胞和破骨细胞之间通信的可能分子机制.方法:采用酶消化法分离原代成骨细胞,并以β-甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松成骨诱导液诱导培养,通过碱性磷酸酶染色及茜素红S染色鉴定成骨细胞分化及矿化功能.收集成骨细胞培养上清液,采用超速离心法提取囊泡分泌物,并通过透射电镜观察囊泡形态,蛋白质印迹法鉴定胞外囊泡表面特征性标志物肿瘤易感基因101(TSG101)、ALG-2相互作用蛋白X(Alix)和分化抗原9(CD9).采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验检测OB-EV对RAW264.7的增殖作用.进一步通过蛋白质印迹法检测OB-EV与核因子κB受体活化因子配体(RANKL)联合作用后RAW264.7破骨分化标志物的表达水平.将OB-EV处理的小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)通过抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察并比较破骨细胞数,明确OB-EV对破骨细胞分化的影响.结果:透射电镜观察提取的OB-EV呈直径为30～150 nm的双层杯状结构,且TSG101、Alix、CD9呈阳性表达.CCK-8实验结果显示高浓度(20 μg/mL以上)OB-EV抑制RAW264.7增殖(P<0.05).蛋白质印迹法检测发现RAW264.7中c-Fos、活化T细胞核因子(NFATc1)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等破骨细胞分化标志蛋白表达明显增加,且随OB-EV浓度增加而增加(P<0.05).此外,将OB-EV与RANKL联合作用于BMM,结果显示TRAP阳性细胞较RANKL对照组显著增多(P<0.05).结论:OB-EV可促进破骨前体细胞向破骨细胞分化,但高浓度OB-EV会抑制细胞增殖.

背景 破骨细胞外泌体参与细胞间通讯,在骨重塑中起重要作用.前体破骨细胞(precursor osteoclast,pOC)外泌体和成熟破骨细胞(mature osteoclast,mOC)外泌体对成骨细胞分化的作用是否存在差异,仍待进一步研究.目的 探究前体破骨细胞和成熟破骨细胞外泌体对成骨细胞分化的作用.方法 利用核因子κB配体受体活化因子和巨噬细胞集落刺激因子刺激骨髓单核/巨噬细胞,诱导破骨细胞分化成熟.提取pOC和mOC分泌的外泌体,对两种外泌体进行表征.分别用两种外泌体干预原代乳鼠颅骨成骨细胞并进行成骨诱导分化,利用荧光标记观察外泌体摄取情况;使用茜素红S(alizarin red S,ARS)染色、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和RT-qPCR评价两种外泌体对成骨分化能力的影响.结果 mOC相较于pOC具有更典型的多核融合结构;两种细胞外泌体粒径均为 100 nm左右,呈圆形盘状,表达外泌体标志性蛋白,均可被原代成骨细胞摄取.mOC外泌体干预组ARS染色钙结节数量与ALP染色深度均高于pOC外泌体干预组(P＜0.05);mOC外泌体干预组成骨相关基因的表达高于pOC组和对照组(P＜0.05).结论 成熟破骨细胞外泌体相较于前体破骨细胞外泌体,促成骨细胞分化能力可能更强.

背景 骨骼肌衰老后质量和功能逐渐下降,其分泌的外泌体对骨代谢具有明显的影响,但衰老骨骼肌外泌体对骨代谢的调控机制尚未明确.目的 探索衰老骨骼肌组织外泌体调控成骨、破骨细胞功能的作用.方法 将2月龄(Young)和24月龄(Old)小鼠骨骼肌组织消化形成单细胞悬液,从中提取的骨骼肌组织外泌体分别为年轻骨骼肌组织外泌体(Young-Exo)和衰老骨骼肌组织外泌体(Old-Exo).通过生物透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)、纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)和Western blot对外泌体进行验证.利用提取的外泌体干预诱导原代成骨细胞成骨分化和诱导骨髓单核巨噬细胞向破骨细胞分化.组织外泌体干预实验分为对照组(PBS组)、年轻组织外泌体组(Young-Exo 组)、衰老组织外泌体组(Old-Exo组).茜素红(alizarin red S,ARS)染色和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测成骨分化水平;抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphase,TRAP)染色检测破骨细胞面积;实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测 Alp、Opn、Ocn、Col1a1、Runx2、Ctsk、Dc-stamp、Atp6v0d2、Mmp-9、Acp5 基因相对表达量.结果Young-Exo组与Old-Exo组的细胞外囊泡均为双层膜结构的圆形囊泡,直径110nm左右,且均表达CD9、CD63、CD81和TSG101等外泌体相关标志蛋白.组织外泌体干预诱导原代成骨细胞成骨分化实验结果显示,与PBS组、Young-Exo组比较,Old-Exo组原代成骨细胞ARS染色的钙盐沉积量和ALP染色强度均下降(P＜0.01),成骨分化基因 Alp、Opn、Ocn、Collal、Runx2的mRNA相对表达量降低(P＜0.01);组织外泌体干预诱导骨髓单核巨噬细胞向破骨细胞分化结果显示,与PBS组、Young-Exo组比较,Old-Exo组TRAP染色的破骨细胞所占面积百分比升高(P＜0.01),破骨细胞相关基因Ctsk、Dc-stamp、Atp6v0d2、Mmp-9、Acp5的mRNA相对表达量升高(P＜0.01).结论 与年轻骨骼肌组织外泌体相比,衰老骨骼肌组织外泌体可能通过抑制原代成骨细胞的成骨分化、促进破骨细胞形成,打破骨代谢的动态平衡,导致骨质疏松症.

目的 探讨碘乙酸单钠(monosodium iodoacetate,MIA)诱导SD大鼠膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)后HIF-1α、OPN、IL-1β、TNF-α、MMP-13和NGF蛋白表达及意义.方法 采用SD大鼠(4周龄,80～120 g)为研究对象,随机分为假手术(Sham)组和模型(KOA)组.第0天,大鼠用戊巴比妥钠麻醉,模型组经右膝关节髌下韧带向关节腔内注射含2 mg MIA生理盐水50 μL,Sham组大鼠给予50 μL灭菌生理盐水.SD大鼠分别于第0、3、7、10、14天测量右膝关节直径和检测负重能力后,麻醉安乐死,切取软骨和分离滑膜组织.同时,原代培养假手术组和模型组滑膜组织,鉴定成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)的纯度和活性后,采用地塞米松处理 FLS.通过 Western Blot 检测缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)和神经生长因子(nerve growth factor,NGF)蛋白的表达.结果 与假手术组比较,大鼠膝关节腔被注入MIA 3 d后,HIF-1α、OPN、IL-1β和TNF-α蛋白表达升高,呈不断增加趋势.大鼠膝关节腔横径,在MIA造模后第7天和第14天,显著大于假手术组.MIA注入大鼠膝关节腔第3天起,大鼠右后肢的负重能力持续在26％以下,显著低于假手术组.采用0.2％Ⅰ型胶原酶消化法,成功培养了 FLS原代细胞.使用地塞米松对模型组大鼠体外FLS干预后,显著降低了促炎因子分泌、NGF和MMP-13蛋白的表达.结论 HIF-1α、OPN、IL-1β、TNF-α、MMP-13和NGF蛋白在滑膜炎症、软骨降解及基质破坏和关节疼痛等方面起着重要作用,既是关节疼痛管理、炎症反应调节和抑制软骨降解和基质破坏的重要靶点,也是开发新型OA镇痛药物的蛋白靶点.

目的 本研究以根尖周囊肿为疾病模型,根据其临床特点确定骨破坏速率,并利用免疫组织化学方法观察间质中微血管密度;同时原代培养囊壁成纤维细胞,检测其中各种VEGF异构体对微血管增生及破骨细胞诱导效率的影响,探讨VEGF可变剪接在牙源性囊肿骨破坏过程中的作用.方法 选取19例根尖周囊肿,以CD34抗体免疫组化染色凸显血管内皮细胞,并计算血管腔面积,曲面断层影像进行病变面积的测量,并选取其中13例新鲜手术标本进行根尖周囊肿囊壁成纤维细胞培养,制备条件培养基和诱导破骨细胞,并进行RNA的提取及realtimePCR检测VEGF异构体的相对表达量.x2检验用于评估CD34阳性的血管腔面积和临床特点.血管腔面积、各种异构体相对表达量、囊肿进展速率和破骨细胞诱导效率的关系由线性回归及Spearman's等级相关评估.结果 VEGF-121a/总VEGF和VEGF-165a/总VEGF正相关于微血管管腔面积,后者则与囊肿骨破坏速率正相关;而VEGF和VEGF-189a的相对表达量正相关于破骨细胞诱导效率,VEGF-165b/总VEGF和VEGF-189b/总VEGF则与破骨细胞诱导效率成负相关.结论 提示VEGF-xxxa型可能主要促进囊肿的骨坏过程,而VEGF-xxxb型则可能有抑制效果.

目的 研究α-倒捻子素对骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞增殖和凋亡的影响.方法 先分离培养人原代OA软骨细胞,分别给予5、10、20 μmol/L的α-倒捻子素处理后24、48、72 h运用MTT法检测细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况;Western blot法检测基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase-1,MMP-1)、MMP-3、MMP-13、过氧化物酶体增殖激活物受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、PPARδ、过氧化物酶增殖激活受体γ共激活子-1α(peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator-1α,PGC-1α)及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达;ELISA法检测细胞培养上清中的Ⅱ型胶原蛋白(collagen-Ⅱ)、蛋白多糖(proteoglycans,PG)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)及IL-6含有量.结果 α-倒捻子素可显著促进细胞增殖,抑制细胞凋亡;显著促进Collagen-Ⅱ和PG的产生;显著抑制MMP-1、MMP-3、MMP-13的表达;显著促进PPARγ、PPARδ、PGC-1α的表达,抑制TNF-α的表达.此外,α-倒捻子素还可显著抑制IL-1β和IL-6的产生.结论 α-倒捻子素可通过增加PPARδ、PPARγ的表达,促进OA软骨细胞增殖,抑制细胞凋亡和炎性反应,从而延缓关节软骨的破坏和退变.

目的 探讨pH值降低对大鼠心肌细胞活力的影响并分析其可能机制. 方法 取新生SD大鼠5只,分离心脏培养原代心肌细胞,进行以下实验.(1)取原代心肌细胞,按照随机数字表法分为pH值7.4 +6 h组、pH值7.0 +6 h组、pH值6.5 +6 h组、pH值6.0+6h组、pH值6.5+1 h组和pH值6.5 +3 h组,每组4孔.pH值7.4 +6 h组、pH值7.0+6 h组、pH值6.5 +6 h组、pH值6.0+6h组细胞常规培养48 h后(下同)分别更换pH值为7.4、7.0、6.5、6.0的DMEM-F12(下同)培养基,培养6 h;pH值6.5+1 h组、pH值6.5 +3 h组细胞更换pH值为6.5的培养基,分别培养1、3h.噻唑蓝法检测细胞活力.(2)取原代心肌细胞,按照随机数字表法分为pH值7.4组、pH值6.5组和pH值6.5+紫杉醇组,每组2孔.pH值7.4组细胞更换pH值为7.4培养基,pH值6.5组和pH值6.5+紫杉醇组细胞更换pH值为6.5培养基,pH值6.5+紫杉醇组细胞另加入终物质的量浓度为0.2μmol/L紫杉醇,培养6h.免疫荧光法检测细胞微管形态及密度.(3)取原代心肌细胞,同实验(2)分组处理,每组2孔,蛋白质印迹法检测细胞聚合态和游离态微管蛋白表达.(4)取原代心肌细胞,同实验(2)分组处理,每组4孔,噻唑蓝法检测紫杉醇处理后细胞活力.对数据行单因素方差分析、LSD-t检验. 结果 (1)pH值7.4+6h组、pH值7.0+6h组、pH值6.5+6h组、pH值6.0+6h组、pH值6.5+1 h组、pH值6.5 +3 h组细胞活力分别为1.00 ±0.08、0.90 ±0.08、0.85±0.06、0.83 ～0.04、0.91 ±0.10、0.89 ±0.10.与pH值7.4 +6 h组比较,pH值7.0+6h组、pH值6.5 +6 h组、pH值6.0+6h组、pH值6.5+1h组、pH值6.5 +3 h组细胞活力均有不同程度下降(t =2.476、4.002、4.996、2.168、2.400,P＜0.05).(2)pH值7.4组细胞微管围绕细胞核呈放射状分布,管状结构清晰;与pH值7.4组比较,pH值6.5组细胞微管骨架破坏明显,表现为管状结构中断、破碎,微管密度降低;pH值6.5+紫杉醇组细胞微管破坏程度较pH值6.5组明显减轻,微管结构基本恢复正常.(3)与pH值7.4组比较,pH值6.5组细胞游离态微管蛋白表达量明显增加(t=3.030,P＜0.05),聚合态微管蛋白表达量明显减少(t=8.604,P＜0.05);与pH值6.5组比较,pH值6.5+紫杉醇组细胞游离态微管蛋白表达量明显减少(t=4.559,P＜0.05),聚合态微管蛋白表达量明显增加(t =5.472,P＜0.05).(4)pH值7.4组、pH值6.5组、pH值6.5+紫杉醇组细胞活力分别为1.00 ～0.10、0.83 ±0.04、0.93 ±0.10.pH值6.5组细胞活力较pH值7.4组明显降低(t=4.412,P＜0.05),pH值6.5+紫杉醇组细胞活力较pH值6.5组明显升高(t=2.461,P＜0.05).结论 pH值降低通过破坏微管骨架引起大鼠心肌细胞活力下降,稳定微管骨架后可明显减轻酸性处理所致损害,改善心肌细胞活力.