目的:探讨去泛素化酶22(USP22)在乳腺癌组织中的表达及对其恶性细胞生物学行为的影响。方法:选取郑州大学第三附属医院2018年9月到2020年1月手术切除的76例乳腺癌和癌旁组织作为研究对象，采用蛋白质组学和蛋白质印迹法(Western blot)分析乳腺组织和癌旁组织的差异表达蛋白及其表达水平。采用慢病毒在乳腺癌细胞MCF-7构建USP22敲降(USP22 KD组)和对照细胞系(对照组)，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)分析两组细胞增殖能力；采用划痕实验分析两组细胞迁移能力；采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)细胞凋亡检测试剂盒分析两组细胞凋亡水平；采用克隆形成实验分析两组细胞克隆形成能力；采用荧光定量PCR分析两组细胞肿瘤干细胞基因；采用Western blot分析分析两组细胞BMI1蛋白表达水平。组间比较采用 t检验。 结果:癌旁组织USP22蛋白平均表达水平(1.08±0.21)明显高于乳腺癌组织(2.62±0.47)，差异有统计学意义( t＝26.190， P<0.05)。USP22 KD组细胞吸光度( A)值(1.39±0.17)明显低于对照组(2.10±0.06)，差异有统计学意义( t＝8.798， P<0.05)。划痕实验结果显示，USP22 KD组细胞迁移数量[(73.40±9.96)个]明显低于对照组[(113.61±11.41)个]，差异有统计学意义( t＝7.382， P<0.05)。对照组细胞凋亡比例[(3.27±0.56)%]明显低于USP22 KD组[(19.49±2.88)%]，差异有统计学意义( t＝12.351， P<0.05)。对照组细胞克隆形成率[(75.41±6.77)%]明显高于USP22 KD组[(36.20±4.21)%]，差异有统计学意义( t＝11.000， P<0.05)。对照组细胞SOX2、OCT4和Nanog mRNA表达水平(1.04±0.10、1.06±0.07、1.06±0.078)明显高于USP22 KD组(0.44±0.08、0.54±0.05、0.52±0.09)，差异有统计学意义( t＝9.318、12.100、10.030， P<0.05)。癌旁组织BIM1蛋白平均表达水平(1.02±0.18)明显高于乳腺癌组织(2.86±0.42)，差异有统计学意义( t＝14.790， P<0.05)。对照组细胞BIM1表达水平(2.24±0.16)明显高于USP22 KD组(1.24±0.16)，差异有统计学意义( t＝9.272， P<0.05)。 结论:USP22在乳腺癌组织中呈高表达，通过调节BMI1表达调控乳腺癌细胞增殖、迁移、凋亡和干细胞特性。

目的:探讨去泛素化酶22(USP22)在食管癌组织中表达水平，分析UPS22对食管癌细胞增殖、上皮-间充质转化、侵袭和转移的影响。方法:选取2021年1月到2022年1月河南省人民医院收治的67例食管癌组织和癌旁组织作为研究对象，采用组织化学分析食管癌和癌旁组织USP22表达水平。采用短发卡RNA(shRNA)技术在人食管癌细胞系SUNE-1中建立USP22敲降细胞系，并建立对照细胞系，分别命名为对照组和USP22 KD组。采用噻唑蓝(MTT)法检测两组细胞的增殖能力；采用蛋白质免疫印迹法检测两组细胞上皮-间充质转化能力；采用Transwell分析两组细胞的侵袭能力；采用异体移植瘤实验分析两组细胞的增殖和转移能力。组间比较采用 t检验。 结果:癌旁组织中USP22表达水平(1.73±0.77)明显低于食管癌组织中USP22蛋白表达水平(2.72±0.52)，差异有统计学意义( t＝8.694， P<0.05)。对照组细胞48 h吸光度值(2.02±0.12)明显高于USP22 KD组细胞(1.57±0.16)，差异有统计学意义( t＝6.031， P<0.05)。对照组细胞在裸鼠体内生长15 d后肿瘤体积(1 219.43±169.61)明显大于USP22 KD组细胞(911.71±146.17)，差异有统计学意义( t＝3.636， P<0.05)。USP22 KD组细胞上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平(1.39±0.14)明显高于对照组细胞(0.52±0.14)，差异有统计学意义( t＝11.531， P<0.05)；对照组细胞间质标志物波形蛋白(Vimentin)和Slug表达水平(1.22±0.11、1.16±0.13)明显高于USP22 KD组细胞(0.51±0.11、0.39±0.09)，差异有统计学意义( t＝12.010、13.171， P<0.05)。对照组细胞侵袭数量[(100.14±15.59)个]明显高于USP22 KD组细胞侵袭数量[(48.86±9.84)个]，差异有统计学意义( t＝7.359， P<0.05)。对照组细胞在裸鼠体内转移数量[(15.29±2.29)个]明显高于USP22 KD组细胞[(6.86±2.27)个]，差异有统计学意义( t＝6.921， P<0.05)。对照组细胞增强子结合蛋白4(AP4) mRNA表达水平(1.25±0.14)明显高于USP22 KD组细胞(0.40±0.13)，差异有统计学意义( t＝11.550， P<0.05)。 结论:USP22蛋白在食管癌组织中呈高表达，通过调节激活AP4转录水平，促进食管癌细胞上皮-间充质转化和转移等细胞生物学特性。

目的:探究泛素特异性肽酶22(ubiquitin specific peptidase 22，USP22)与乙型肝炎病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)相互作用对HBx蛋白水平及其生物学功能的影响。方法:通过GST pull-down、免疫共沉淀以及激光共聚焦试验检测HBx与USP22的相互作用。瞬时转染USP22真核表达质粒或干扰USP22表达的siRNA，Western blot检测肝细胞中HBx蛋白表达水平的变化。以环己酰亚胺(cycloheximide，CHX)、蛋白酶体抑制剂MG132(carbobenzoxy-Leu-Leu-leucinal，MG132)分别处理转染后的细胞，检测HBx蛋白的降解速率。进一步通过细胞内泛素化试验检测USP22对HBx泛素化的影响，明确USP22影响HBx蛋白稳定性的具体机制。最后，以双荧光素酶报告试验和平板克隆试验检测USP22对HBx生物学功能的影响。结果:USP22与HBx存在相互作用。USP22显著增加HBx蛋白稳定性，并通过去除HBx的泛素化抑制HBx通过蛋白酶体降解，进而增强HBx的生物学功能。结论:USP22抑制HBx通过泛素依赖-蛋白酶体途径降解，增强HBx蛋白稳定性并促进HBx功能。

目的 探索去泛素化酶USP22在多囊卵巢综合征(PCOS)发病过程中的作用及机制.方法 利用脱氢表雄酮(DHEA)诱导建立小鼠PCOS模型,免疫组化及Western blot检测USP22在PCOS模型小鼠及对照小鼠卵巢组织中的表达变化;在卵巢颗粒细胞系(KGN)细胞中加入500 nmol/L双氢睾酮(DHT)模拟PCOS颗粒细胞中的高雄状态,并构建靶向USP22的siRNA,敲低KGN细胞中USP22的表达,对照组加入空白siRNA,CCK-8检测各组细胞的增殖变化,RT-PCR检测细胞周期相关分子的mRNA表达水平,Western blot检测细胞周期相关蛋白及信号通路相关蛋白表达情况.结果 USP22蛋白主要定位于卵巢颗粒细胞的细胞核,且在PCOS小鼠卵巢组织中USP22表达显著低于正常小鼠(P＜0.05).细胞实验结果表明:敲低USP22后,KGN细胞的增殖能力显著下降(P＜0.05),RT-PCR及Western Blot结果显示细胞周期相关蛋白Cyclin B1、Cyclin D1、Cyclin E1的mRNA及蛋白表达水平均显著下降(P＜0.05);而在KGN细胞中敲低USP22的同时加入DHT,KGN细胞增殖能力及相关分子表达下降更为显著(P＜0.05);另外,敲低USP22后,KGN细胞中信号通路相关蛋白p-PI3K和p-AKT的表达水平显著下降(P＜0.05).结论 去泛素化酶USP22可通过PI3K/AKT信号通路调控KGN细胞的增殖,从而影响PCOS的发病.

目的:探究TRIM2 通过泛素化修饰PKM2 调控肝癌细胞糖酵解的机制.方法:TCGA和CPTAC数据库分析TRIM2 基因及蛋白表达水平,并结合病人生存状态进行相关性分析.构建HepG2-shNC和HepG2-shTRIM2 细胞株,细胞能量代谢仪检测两组细胞胞外酸化率和耗氧率,并测定细胞葡萄糖吸收率、乳酸产生量、ATP水平.免疫共沉淀验证TRIM2 和PKM2 在HepG2、HEK293T细胞中相互作用,免疫荧光检测PKM2 和TRIM2 共定位.免疫共沉淀检测在HepG2/HEK293T细胞中敲低/过表达TRIM2 后PKM2的泛素化修饰水平,体外酶催化反应检测在HepG2/HEK293T细胞中敲低/过表达TRIM2 后PKM2 酶活性.Transwell小室法检测 HepG2-shNC 和 HepG2-shTRIM2 细胞侵袭和迁移能力.皮下移植瘤实验检测HepG2-shNC和HepG2-shTRIM2 细胞体内成瘤能力.结果:TCGA和CPTAC数据库分析发现TRIM2 在肝癌组织中mRNA及蛋白表达水平均升高,高TRIM2 表达预示差的患者生存状态.TRIM2 表达水平与糖酵解通路相关性高,敲低 TRIM2 可抑制 HepG2 胞外酸化率,提高耗氧率,细胞葡萄糖吸收率[(100.000 0±2.000 0)%vs(46.666 7±8.144 5)%]、乳酸产生量[(99.000 0±3.605 5)%vs(43.666 7±10.016 65)%]、ATP水平[(97.000 0±3.605 5)%vs(57.333 3±6.658 3)%]均显著下调.TRIM2 与PKM2 在HepG2 细胞中相互作用且蛋白共定位.TRIM2 抑制后 HepG2 细胞中 PKM2 泛素化水平升高,PKM2 酶活性降低;在HEK293T细胞中表达Myc-TRIM2,下调PKM2 蛋白泛素化修饰水平,提高PKM2 酶活性.敲低TRIM2抑制HepG2细胞侵袭能力(1 vs0.506 7±0.116 8)、迁移能力(1 vs0.513 3±0.086 22),抑制细胞体内成瘤体积[(529.333 3±29.280 26)mm3 vs(281.666 7±25.696 9)mm3]和重量[(360.333 3±42.716 1)mg vs(172.166 7±50.284 9)mg].结论:TRIM2 在肝癌组织中高表达,通过去泛素化修饰PKM2促进其酶活性,进而调控肿瘤细胞糖酵解能力.

目的 探讨自噬和UCH-L3在急性髓细胞白血病发生发展过程中的作用机制和相互关系,为白血病的诊断及治疗提供新的靶点和策略.方法 选取2014至2015年大连医科大学附属第一医院收治的84例AML患者(男47例,女37例)及健康体检对照组25名(男13名,女12名).AML初发组40例(男24例,女16例),中位年龄54岁(23～85岁);缓解组30例(男14例,女16例),中位年龄45岁(22～74岁);难治组14例(男9例,女5例),中位年龄50岁(18～80岁),其中M1型3例、M2型42例、M3型18例、M4型3例及M5型18例.HL-60细胞采用Real Time PCR及Western Blot法检测TCID处理前后UCH-L3和LC3II的表达变化.AML患者及对照组采用Real Time PCR方法检测外周血单个核细胞UCH-L3和LC3II基因mRNA的表达情况;比较其在初发组、缓解组、难治组及对照组间表达情况;分析AML不同型别之间UCH-L3和LC3II的表达水平;比较AML初发组LC3Ⅱ基因表达的高低与临床特征、临床分期、实验室检查结果及治疗效果的关系.追踪同一患者治疗前后UCH-L3及LC3ⅡmRNA的表达变化.计量资料用t检验,率的比较用χ2检验;相关性分析采用秩相关检验;不符合正态分布的数据用非参数检验.结果 TCID处理HL-60细胞后,UCH-L3及LC3 II在基因和蛋白水平上与未处理组相比表达均下调,差异有统计学意义(t=-29.435及-8.105,P均<0.05);AML初发组的UCH-L3表达量较健康对照组下调,差异有统计学意义(Z=-3.87,P<0.05);AML缓解组UCH-L3表达量与初发组和难治组相比均高表达,差异有统计学意义(Z分别为-6.70和-4.09,P均<0.05);AML初发组LC3Ⅱ的表达量与健康对照组,缓解组和难治组相比均高表达,差异有统计学意义(Z分别为-6.96、-5.32和-3.52,P均<0.05);LC3Ⅱ高表达组患者细胞遗传学异常更为常见(χ2=6.510,P<0.05);同一患者治疗前后UCH-L3及LC3Ⅱ的相对表达量均有显著差异(t=5.315及-7.353,P均<0.05),经化疗缓解后UCH-L3的表达量较初发治疗前上调,而LC3Ⅱ的表达量下调;初发与缓解组的AML患者各型别间UCH-L3及LC3Ⅱ的相对表达量无差异(F分别为0.014及0.143,P均>0.05).结论 UCH-L3和自噬可以通过相互协同作用而调控AML的发生发展.

目的 研究miR-34b调控其靶基因USP22分子机制及其在急性髓细胞白血病细胞HL60中的生物学效应.方法 荧光定量PCR (qPCR)检测miR-34b、USP22转录水平;蛋白免疫印迹(Western blotting)检测USP22、Bax、Bcl-2蛋白表达水平;急性髓细胞白血病HL60细胞中过表达、抑制miR-34b或干扰USP22后,CCK-8及Annexin-V分别检测细胞增殖活性及凋亡变化.双荧光素酶报告基因系统证实miR-34b与USP22的3’非编码区(3’-UTR)相互作用.结果 miR-34b在白血病细胞HL660中表达下调,为外周血健康对照单个核细胞的0.46±0.07倍(P＜0.01).与对照细胞相比,在HL60细胞中过表达miR-34b或抑制miR-34b后,细胞相对活性分别出现减低或增强现象(P＜0.01).miR-34b在HL60中过表达后,凋亡细胞(29.91 ±1.14)％较对照细胞(8.77±0.23)％增加了2.41倍(P＜0.01),Western印迹检测证实了促凋亡分子Bax及抑制凋亡分子Bcl-2在miR-34b过表达后分别出现了上调及下调现象.利用在线预测软件预测USP22可能是miR-34b直接调控基因.在HL60细胞中过表达或抑制miR-34b后,USP22转录水平及蛋白表达水平均不同程度上调及下调(P＜0.01).双荧光素酶报告基因系统证实miR-34b过表达后,USP22野生型的3’-UTR较对照组显著下调(P＜0.01),而突变型无显著改变.进一步敲减USP22后HL60细胞增殖活性减低,并诱导细胞凋亡.结论 miR-34b对白血病细胞HL60的抑癌活性可部分通过抑制USP22得以实现;同时过表达miR-34b或抑制USP22表达有望成为急性髓细胞白血病的诊治靶点.

目的 探讨周期性张应变条件下诱导血管平滑肌细胞(VSMC)表型转换时,心肌素在其中可能的作用.方法 应用FX-5000T体外周期性张应变加载系统,分别对体外培养的VSMC施加频率为1.25 Hz、加载幅度为5％(正常张应变状态)、15％(高张应变状态)的周期性张应变力学刺激,加载时间为24h.采用蛋白免疫印迹法和实时荧光定量PCR技术检测心肌素、肌肉萎缩相关基因1(atrogin-1)及相关收缩蛋白SMA、SM22的蛋白表达水平和mRNA水平;敲除atrogin-1后测心肌素及相关收缩蛋白SMA、SM22的变化;用蛋白酶体抑制剂MG132处理后测心肌素和atrogin-1的表达水平.结果 与5％正常张应变组比较,15％高张应变促进平滑肌细胞的去分化.15％高张应变下调心肌素和SMA、SM22蛋白水平;上调atrogin-1蛋白表达水平;下调心肌素和SMA、SM22的mRNA水平,上调atrogin-1 mRNA水平.应用siRNA特异性下调atrogin-1后,心肌素、SMA、SM22蛋白水平均上升.用1 μmol/L MG132处理细胞后,心肌素、SMA、SM22的蛋白水平上升,atrogin-1蛋白水平下降.结论 周期性高张应变可以通过调节血管平滑肌细胞中atrogin-1/心肌素轴来调控血管平滑肌表型转换,进而影响VSMC的分化增殖.

泛素特异性酶22(USP22)是哺乳动物中一种高度保守的泛素水解酶,通过对底物蛋白的去泛素化修饰阻止蛋白降解,参与调节基因转录、DNA损伤修复及胚胎发育等生命过程,已被证实调控多种途径介导肿瘤的发生发展.本文着重讨论USP22通过去泛素化修饰功能调节肿瘤发生发展的相关作用机制.

目的 证实去泛素化酶USP22参与雌激素受体α(ERα)介导的基因转录调控进而在血管钙化中发挥重要作用.方法 将人主动脉平滑肌细胞(hASMC)分别接种于正常培养基、含1.25 mmol/L CAL、2.5 mmol/L CAL、5 mmol/L CAL的培养基中培养0、3、7、9天.用1％/2％茜素红染色,倒置相差显微镜观察钙化情况;在5 mmol/L CAL条件下培养0、3、7、9天,Western blot实验检测钙化相关蛋白骨形态发生蛋白2(BMP-2)、核因子κB的受体激活剂配体(RANKL)、环氧合酶2(COX-2)、vitk依赖的分泌性蛋白(Gas6)、ERα的蛋白表达;双荧光素酶报告基因实验检测在hASMC中,USP22是否参与ERα介导的基因转录调控;过表达USP22,Western blot实验检测钙化相关因子BMP-2、RANKL、COX-2、Gas6和ERα的蛋白表达.结果 在1.25 mmol/L CAL条件下培养到第9天,hASMC有明显的钙沉积;在2.5 mmol/L CAL、5 mmol/L CAL条件下培养到第7天hASMC出现钙沉积,第9天有明显钙沉积.hASMC在5 mmol/L CAL培养条件下,RANKL、BMP-2、USP22蛋白表达增加.双荧光素酶报告基因实验检测结果表明,在hASMC中USP22抑制ERα介导的基因转录调控;Western blot实验结果显示,过表达USP22,ERα的下游基因Gas6蛋白表达减少.结论 在5 mmol/L CAL培养的条件下,hASMC钙化模型建立成功;USP22可能通过抑制ERα介导的下游基因Gas6的基因转录进而促进hASMC钙化.