黑曲霉是有机酸与酶制剂重要的工业生产菌株,具有强大的水解酶系与葡萄糖转运系统,可快速响应胞外碳源变化,摄取环境中葡萄糖供给细胞生长和产物合成.作为重要的碳源底物与关键的信号分子,葡萄糖的摄取吸收直接影响黑曲霉细胞生长与发酵性能.针对目前丝状真菌缺乏简便葡萄糖吸收能力定量表征方法的问题,本文以 2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)作为葡萄糖吸收探针,通过将预培养的黑曲霉孢子与 2-NBDG孵育后,利用荧光显微成像与流式细胞分析,建立了丝状真菌的葡萄糖吸收的定量检测方法.结果发现,2-NBDG 的最佳使用浓度为 150 μmol/L,最佳孵育时间为4 h.进一步利用该定量分析方法,发现低亲和力葡萄糖转运蛋白MstC的过表达使黑曲霉葡萄糖吸收提高 1.44 倍,同时在前期研究的基础上,利用多序列比对分析,设计了MstC的突变体R188K,通过检测发现该点突变可直接导致MstC葡萄糖转运活性的丧失,这表明Arg188 是影响MstC葡萄糖转运能力的关键氨基酸位点.本文葡萄糖摄取定量检测方法的建立及其在MstC功能研究上的应用,不仅加深了丝状真菌葡萄糖吸收的定量认识,也为葡萄糖转运系统的改造优化提供了技术支撑.

木质纤维素类生物质是前景广阔的化石原料替代品,其生物炼制可生产生物能源、生物基化学品和生物材料等多种产品,可降低碳排放,有助于实现"双碳"目标,因此受到越来越多的关注.然而,木质纤维素生物炼制需要经过预处理、微生物发酵和产物纯化等多个步骤,其中,预处理过程产生的多种化合物抑制微生物的细胞生长和发酵性能,是制约生物转化效率的瓶颈之一.大肠杆菌是木质纤维素生物炼制常用的宿主,被广泛应用于多种化合物的生产,研究其对木质纤维素水解液中抑制物的耐受性,对于提高木质纤维素生物炼制效率具有重要意义.本文首先介绍了木质纤维素的主要成分和基本结构,对木质纤维素的预处理方法以及预处理后水解液中的主要抑制物种类进行了简单阐述;随后,总结了木质纤维素水解液中几类主要抑制物呋喃类、羧酸类和酚类对大肠杆菌细胞的毒性,以及大肠杆菌对上述抑制物的胁迫响应机制和基于机制的菌株改造靶点;最后,综述了提高大肠杆菌对上述抑制物的胁迫耐受性的菌株改造策略,包括随机突变、实验室适应性进化和组学辅助的理性设计等,为利用代谢工程构建用于木质纤维素生物炼制的高效大肠杆菌菌株提供参考.

黑曲霉表面展示南极假丝酵母脂肪酶B (CALB)可有效应用于食品、化妆品、医药等行业.以黑曲霉Aspergillus niger SH-1为宿主细胞构建诱导型糖化酶基因启动子表面展示CALB,在较高浓度葡萄糖碳源的发酵中CALB表达会受到抑制,发酵后期菌体容易出现菌丝断裂和展示酶活力下降等问题.采用组成型3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子替代诱导型糖化酶基因启动子的细胞表面展示CALB黑曲霉菌株可有效解决上述问题,该菌株不但可以利用葡萄糖,而且还能利用木糖为发酵碳源,以木糖为碳源发酵在144 h展示酶水平达到1 100.28 U/g.文中探讨了甘蔗渣水解液发酵生产黑曲霉表面展示CALB,初步达到预期的结果,为甘蔗渣的综合利用提供了新途径.

[目的]明确贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillus velezensis) L-1对梨灰霉和青霉病菌的抑制作用, 明确菌株L-1无菌发酵液拮抗活性的稳定性及可能的拮抗机制.[方法]通过离体测定、活体测定和病原菌菌丝形态观察, 评价菌株L-1对梨灰霉和青霉病菌的拮抗活性.以梨灰霉病菌为供试病原菌, 利用牛津杯法测定菌株L-1无菌发酵液拮抗活性的稳定性.利用Pacbio RSII三代测序技术测定L-1的全基因序列, 将全基因序列与基因蛋白质序列数据库进行BLAST比对分析, 预测菌株L-1可能产生的次生代谢产物及潜在的作用机制.[结果]菌株L-1对梨灰霉和青霉病菌的活体抑制率分别为92.88％和77.47％, 能引起病原菌菌丝膨大、畸形.菌株L-1在含10％Na Cl的培养液中仍能正常生长, 其无菌发酵液耐高温、酸、碱、紫外照射和蛋白酶降解, 对病原菌具有稳定的拮抗活性.全基因序列分析结果显示菌株L-1有112个基因参与了多种碳源的代谢, 可以利用多种碳源进行生长;含有参与亚精胺、海藻糖等与菌株抗逆性相关化合物合成的基因;次生代谢产物预测结果显示:L-1含有合成surfactin、fengycin、bacillibactin、bacillaene、macolactin、difficidin、bacilysin等多种肽聚糖和聚酮糖类抗性化合物的基因簇, 以及能够降解病原菌细胞壁的β-1, 3-葡聚糖酶和几丁质酶相关的基因;此外菌株L-1含有生成乙偶姻等能够诱导植物抗性的基因.[结论]菌株L-1能有效拮抗多种梨果采后病害, 抗逆性强, 拮抗活性稳定, 预测菌株L-1能够通过产生多种拮抗活性化合物和细胞壁水解酶类以及诱导植物抗性实现防病效果, 具有很大的应用潜力.

发酵碳源对铜绿假单胞菌NY3(Pseudomonas aeruginosa NY3)产鼠李糖脂(Rhamnolipids,Rha)的特性影响较大.研究了利用废弃动物油作为发酵碳源时,其碱预水解和酶预水解对NY3菌发酵产鼠李糖脂产量、产物结构和性能的影响,从碳源水解酸值与水解产物、鼠李糖脂组分结构和实际应用效果进行了研究.碱、酶预水解实验发现,碳源酸值由初始的19.81 mg/g分别提高到72.04 mg/g和73.75 mg/g,气质联用(GC-MS)分析检测结果表明,碱、酶预水解后,碳源均释放7种C14-C18碳链的脂肪酸,鼠李糖脂产量由未预水解的8.28 g/L分别提高到15.35 g/L和17.63 g/L.液质联用(LCMS-IT-TOF)分析结果表明,用未预水解及碱、酶预水解碳源发酵时,NY3菌所产鼠李糖脂中单糖脂含量分别为62.07％ 、65.67％ 、87.32％.利用NY3菌在中试条件下处理高浓度石化企业油污泥,发现鼠李糖脂能促进NY3菌去除油污泥中的石油烃,且促进作用强弱顺序为未预水解产Rha>碱预水解产Rha>酶预水解产Rha.

木质纤维素是地球上储量最为丰冨的可再生有机碳资源,但由于其结构的复杂性,必须经过一系列预处理过程才能被微生物高效利用,这就不可避免地带来了呋喃醛等典型抑制物,严重阻碍了微生物的生长和后续发酵过程.认知微生物的呋喃醛代谢途径,并基于此开发耐受性和转化能力强的微生物菌株是生物炼制领域的重要研究内容.文中综述了呋喃醛抑制物的来源、呋喃醛对微生物的抑制机理以及微生物降解呋喃醛的代谢途径,并重点讨论了基于生物法降解呋喃醛抑制物的研究进展,涉及的主要技术手段包括传统的适应性进化工程和代谢工程,以及近年来新兴的微生物共培养系统和功能化材料辅助微生物脱除呋喃醛等.

纤维素酶在饲料、造纸、纺织和纤维素乙醇生产等领域有重要用途,因而备受关注.使用稻草为唯一碳源进行纤维素降解微生物的富集,从云南大理苍山地区的土壤样品中筛选获得1株纤维素降解真菌DLCS-F18,其适宜生长温度为15-40℃、pH 2.0-13.0.通过形态学和ITS rRNA分子生物学鉴定,菌株DLCS-F18被鉴定为曲霉属菌株Aspergillus sp..使用稻草发酵培养基进行诱导,发现该菌株所产纤维素酶的最适pH为4.0,最适温度为65℃,在pH 3.0保持85％的活性,在75℃保持70％以上的活性,在大多数金属离子和酶抑制剂存在的条件下活性表现稳定.菌株发酵84h的上清对羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的最高活性为(5.4±0.2)U/mL.这说明DLCS-F18所分泌的纤维素酶是嗜酸嗜热纤维素酶,其酶学特性预示着菌株在木质纤维素水解和动物饲料中具有广阔的应用前景.

纤维素乙醇是以农业废弃生物质中的纤维素为主要原料、通过微生物发酵转化而成的生物燃料产品.作为一种绿色可再生替代能源,纤维素乙醇具有显著的能量收益和碳减排效益,对保障我国可持续发展、能源安全以及环境友好意义重大.然而,纤维素乙醇的生物炼制过程面临着难点和挑战.本文围绕纤维素原料及其预处理、纤维素酶水解和纤维素乙醇发酵工艺3个方面,介绍纤维素乙醇生物炼制的工艺流程及特征,剖析纤维素乙醇生产的主要技术瓶颈,并基于菌株抑制物胁迫耐性、碳源利用以及乙醇合成强化3个方面,总结了近年来纤维素乙醇生物炼制的研究进展,最后对纤维素乙醇未来的研究重点和发展前景进行了展望.

[目的]Pseudomonas boreopolis GO2可以利用木质纤维素类生物质为唯一碳源发酵产微生物絮凝剂.解析菌株GO2的全基因组特征可为利用木质纤维素类生物质定向合成多糖型微生物絮凝剂提供分子基础.[方法]利用Illumina NovaSeq测序平台对菌株GO2进行测序,用SMRT等软件进行基因组组装、系统发育分析、基因预测和功能注释,并与4株近缘模式株进行了比较基因组分析.[结果]菌株GO2基因组大小为4 498 896 bp,GC含量为69.5％,共编码3 906个基因.菌株GO2与Pseudomonas boreopolis JCM 13306的16S rRNA基因相似性、平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)、DNA-DNA 杂交(DNA-DNA hybridization,DDH)值最高,分别为99.93％、98.36％和 88.00％,将菌株 GO2 命名为 Pseudomonas boreopolis GO2.比较基因组分析发现,GO2与4个近缘模式菌株共有2 348个直系同源核心基因,主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢以及能量代谢等过程,而GO2菌株特有的307个基因主要与转录、复制、修复、细胞壁/膜/包膜的生物发生相关.菌株GO2基因组中含有226个碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes,CAZymes)基因,占总基因数的5.79％,包括82个与植物细胞壁降解相关的糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)家族基因和由糖基转移酶(glycosyltransferases,GTs)家族基因形成的3个多糖合成基因簇.[结论]根据菌株GO2基因组序列的比对分析,将其命名为Pseudomonas boreopolis GO2,其基因组中包含丰富的植物细胞壁降解酶基因和3个多糖合成基因簇,这些基因可能在菌株GO2直接利用木质纤维素类生物质合成微生物絮凝剂过程中发挥着重要作用.