目的 探究原发免疫性血小板减少症(ITP)患者CD4+T细胞的糖代谢特征,并阐明其对CD4+T细胞功能的调节作用.方法 纳入92例ITP患者和46例健康对照者.采用流式细胞术评估细胞渗透性荧光葡萄糖(2-NBDG)摄取及糖代谢相关酶(GLUT1、LDHA、PKM2、HK2和PFKPB3)的表达;利用免疫磁珠法分离CD4+T细胞,采用2-脱氧葡萄糖(2-DG)抑制糖摄取后,流式细胞术评估淋巴细胞活化情况,CCK8检测细胞增殖,ELISA方法检测培养上清中IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β1水平.结果 与健康对照组相比,ITP患者CD4+T细胞离体、体外静息及重刺激后的葡萄糖摄取能力增加(离体:9.32%±1.67%比3.15%±0.41%,P<0.01;静息:12.92%±2.10%比4.87%±1.08%,P=0.02;重刺激:25.52%±3.44%比14.71±3.50%,P=0.03).ITP患者CD4+T细胞表面GLUT1表达增加(GLUT1:27.70%±2.13%比18.12%±2.22%,P<0.01).2-DG抑制葡萄糖摄取后,ITP患者CD4+T细胞增殖、CD25+晚期活化T细胞比例减少[增殖(OD):0.40±0.14比0.25±0.04,P=0.03;活化:14.65%±2.42%比8.71%±1.11%,P<0.01],培养上清中IL-17水平降低,而IL-4水平升高(IL-17:0.70±0.11 ng/L比0.44±0.06 ng/L,P=0.03;IL-4:1.36±0.25 ng/L比2.20±0.47 ng/L,P=0.02).结论 ITP患者CD4+T细胞糖代谢增加可能通过促进CD4+T细胞活化及极化偏移参与ITP的发生.

目的:探讨胰升糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)司美格鲁肽改善棕榈酸诱导C2C12骨骼肌细胞萎缩的机制。方法:C2C12细胞分为对照组、0.5 mmol/L棕榈酸组、0.5 mmol/L棕榈酸＋15 nmol/L司美格鲁肽组、0.5 mmol/L棕榈酸＋90 nmol/L司美格鲁肽组及0.5 mmol/L棕榈酸＋900 nmol/L司美格鲁肽组，CCK-8检测各组细胞存活率，2-NBDG荧光探针检测各组细胞葡萄糖摄取情况，免疫荧光法检测肌管直径，Western印迹法检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Ⅲ型纤维连接蛋白结构域5(FNDC-5)、肌球蛋白重链(MHC)、肌细胞生成素(MyoG)、肌肉萎缩盒F基因(Atrogin-1)及肌肉环状指基因1(MuRF-1)蛋白的表达水平。结果:与对照组相比，棕榈酸组细胞存活率及葡萄糖摄取均明显降低，肌管直径减小，p-Akt、GLUT4、FNDC-5、MHC及MyoG蛋白表达水平显著下降，Atrogin-1及MuRF-1表达显著升高(均 P<0.05)，15、90和900 nmol/L司美格鲁肽增加细胞存活率、葡萄糖摄取和肌管直径，以及p-Akt、GLUT4、FNDC-5、MHC和MyoG的蛋白表达水平，降低Atrogin-1及MuRF-1蛋白表达(均 P<0.05)。 结论:司美格鲁肽可改善棕榈酸诱导的C2C12细胞胰岛素抵抗，并通过促进肌细胞合成、抑制肌细胞降解，改善肌细胞萎缩，FNDC-5可能参与其中。

目的:探讨N-myc下游调节基因2(N-myc downstream regulated gene 2，NDRG2)在癫痫小鼠海马中的表达及其对小鼠脑星形胶质细胞谷氨酸和葡萄糖摄取的影响。方法:采用氯化锂-匹鲁卡品诱导法建立癫痫小鼠模型，在造模后1 d、7 d、15 d、6周处死小鼠取取海马区脑组织，Western blot检测NDRG2蛋白表达变化。原代培养野生型、NDRG2 ＋/＋和NDRG2 -/-小鼠的星形胶质细胞并进行基因型鉴定。使用谷氨酸含量测定试剂盒及紫外分光光度计检测星形胶质细胞培养上清液中谷氨酸含量。流式细胞术检测2-NBDG荧光标记星形胶质细胞的阳性率。 结果:(1)与对照组(0.25±0.07)比较，小鼠海马区NDRG2表达量在癫痫急性期1 d(0.45±0.06， t＝－3.84， P<0.05)、7 d(0.54±0.09， t＝－4.30， P<0.05)、15 d(1.04±0.06， t＝－15.08， P<0.01)均有明显增加，癫痫慢性期6周(1.30±0.16， t＝－10.40， P<0.01)依然保持明显的高表达。(2)检测原代细胞培养上清液剩余的谷氨酸含量，发现NDRG2 -/-组星形胶质细胞对谷氨酸的摄取相对于NDRG2 ＋/＋组明显减少[(689.03±101.78)μmol/L，(113.67±37.35)μmol/L； t＝9.19， P<0.01]。(3)Western blot分析NDRG2 -/-组原代星形胶质细胞中EAAT1蛋白的表达显著低于NDRG2 ＋/＋组[(0.34±0.03)，(1.16±0.21)]，差异有统计学意义( t＝－6.59， P<0.01)。(4)流式细胞术检测发现，NDRG2 -/-组细胞的阳性率明显低于NDRG2 ＋/＋组细胞阳性率[(17.60±5.72)%，(72.22±8.35)%]，差异有统计学意义( t＝－13.22， P<0.01)。 结论:NDGR2与癫痫疾病的发生发展密切相关。NDRG2的表达有利于EAAT1发挥其生理功能，促进星形胶质细胞对谷氨酸和葡萄糖的摄取，可能是一种潜在细胞保护因子，促进神经保护和修复。

目的:探讨内质网应激（ERS）对妊娠期糖尿病（GDM）滋养层细胞的影响。方法:选取GDM产妇22例（GDM组）和健康产妇22例（健康组），电镜和TUNEL分别观察胎盘组织滋养细胞内质网、凋亡情况，免疫印迹检测GRP-78、CHO、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达。衣霉素（0、0.5、1、2 μg/ml）处理人HTR-8/SVneo细胞并检测GRP-78、CHOP蛋白表达，流式细胞法检测细胞凋亡，酶联免疫法检测TNF-α、IL-6和IL-1β水平；2-NBDG法检测胰岛素刺激下人HTR-8/SVneo细胞的葡萄糖摄取情况并分析GLUT4和相关途径蛋白表达情况。结果:GDM组胎盘滋养细胞内质网体积增大，胎盘滋养细胞凋亡指数和CHOP、GRP78、cleaved-caspase-3/caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白表达高于健康组（ P<0.05）。与衣霉素（0、0.5 μg/ml）组相比，衣霉素（1、2 μg/ml）组细胞凋亡率、TNF-ɑ、IL-6、IL-1β水平和CHOP、GRP78蛋白表达均升高（ P<0.05），有剂量效应。与对照组相比，ERS组葡萄糖摄取率和GLUT4、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表达减低（ P<0.05），p-IRS-1蛋白表达升高（ P<0.05），胰岛素刺激组上述指标趋势相反，在ERS基础上增加胰岛素刺激可以部分逆转ERS效果。 结论:ERS可促进滋养细胞凋亡，提高炎症反应，降低细胞葡萄糖摄取，增强胰岛素抵抗。

目的 探讨金复康口服液联合吉非替尼对肺腺癌H1975 细胞有氧糖酵解的影响.方法 首先采用CCK-8 法检测不同浓度金复康口服液和吉非替尼对H1975 细胞增殖的影响;然后实验分为空白组、吉非替尼组、金复康口服液组和联合用药组,采用 2-NBDG荧光探针和乳酸测试盒分别检测各组细胞葡萄糖摄取能力及乳酸生成量,酶活性试剂盒检测细胞中糖酵解关键限速酶[己糖激酶(HK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸激酶(PK)]的活性,Western blot法检测细胞中己糖激酶2(HK2)、P型磷酸果糖激酶(PFKP)、M2 型丙酮酸激酶(PKM2)蛋白表达情况,JC-1、DCFH-DA荧光探针分别检测细胞线粒体膜电位和活性氧(ROS)水平.结果 金复康口服液对H1975 细胞的生长抑制作用呈时间和剂量依赖性增强,差异均有统计学意义(P均＜0.05);与不同浓度吉非替尼单独作用48h比较,相应浓度吉非替尼联合金复康口服液作用后的H1975 细胞增殖抑制率均更高(P均＜0.05).各给药组细胞葡萄糖相对摄取量与空白组比较差异均无统计学意义(P均＞0.05);各给药组细胞乳酸生成量均明显低于空白组(P均＜0.05),且联合用药组明显低于吉非替尼组和金复康口服液组(P 均＜0.05);吉非替尼组 PFK、PK 活性,金复康口服液组HK、PFK活性,联合用药组HK、PFK、PK活性均明显低于空白组(P均＜0.05),且金复康口服液组与联合用药组HK、PFK活性均明显低于吉非替尼组(P均＜0.05).金复康口服液组和联合用药组HK2、PFKP、PKM2 蛋白相对表达量及吉非替尼组PFKP蛋白相对表达量均明显低于空白组(P均＜0.05),且金复康口服液组和联合用药组HK2、PFKP、PKM2 蛋白相对表达量均明显低于吉非替尼组(P均＜0.05).与空白组比较,各给药组细胞线粒体膜电位明显下降,ROS明显增加,且联合用药组细胞线粒体膜电位下降和ROS增加更明显.结论 金复康口服液能通过抑制有氧糖酵解途径,降低细胞线粒体膜电位,促进ROS产生,增加H1975 细胞对吉非替尼的敏感性.

目的:探讨白术内酯Ⅰ通过SGLT1/NHE3通路治疗腹泻的机制.方法:Caco-2细胞建立体外肠道吸收模型,将细胞分别设为空白对照组、抑制剂(SGLT1抑制剂根皮苷、P38MAPK抑制剂SB203580、Ezrin抑制剂NSC668394)组、白术内酯Ⅰ组、白术内酯Ⅰ+抑制剂组,采用2-NBDG测定白术内酯Ⅰ对Caco-2细胞葡萄糖摄取的影响;Western Blot 法检测 SGLT1、p-P38MAPK、p-MAPKAPK2、p-AKT2、p-Ezrin、MLCK、p-MLC、NHE3 等蛋白表达,荧光定量PCR检测SGLT1、MLCK、NHE3 mRNA表达.结果:白术内酯Ⅰ促进Caco-2细胞葡萄糖摄取,上调SGLT1、NHE3、MLCK的表达;此外,白术内酯Ⅰ增加了MLCK和P38MAPK/Ezrin信号通路中的蛋白磷酸化.结论:白术内酯Ⅰ可激活SGLT1促进Caco-2细胞葡萄糖摄取,通过P38MAPK/Ezrin信号通路上调其下游靶点NHE3和MLCK促进水钠吸收是其治疗腹泻的机制之一.

目的 研究荭草素和异荭草素降血糖的靶点及其体外活性.方法 从蛋白质数据库(www.rcsb.org)获取糖尿病相关靶点蛋白结构,利用虚拟分子对接打分评价荭草素和异荭草素与糖尿病相关靶点的结合强弱;基于分子对接的结果,采用荧光标记的 1-脱氧葡萄糖(1-NBDG)、4-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷PNDG(PNPG)、对硝基苯酚磷酸酯(pNPP)作为底物对荭草素和异荭草素进行体外抑制α-葡萄糖糖苷酶、钠-葡萄糖协同转运蛋白 2(SGLT2)和蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(PTP1B)活性评价.结果 荭草素与α-葡萄糖苷酶、SGLT2、和PTP1B的分子对接得分分别为-5.67、-9.32、-4.75,异荭草素与α-葡萄糖苷酶、SGLT2 和 PTP1B 的分子对接得分分别为-5.34、-8.63、-4.93,而阳性对照药与靶标的分子对接打分依次是-5.58、-9.79、-9.28.体外实验显示,荭草素对α-葡萄糖苷酶、SGLT2、PTP1B的抑制率依次是(16.7±5.8)%、(15.4±1.2)%、(3.0±0.5)%,异荭草素对α-葡萄糖苷酶、SGLT2、PTP1B的抑制率依次是(11.8±3.8)%、(9.4±1.1)%、(-3.8±0.6)%,而阳性对照对α-葡萄糖苷酶、SGLT2、PTP1B的抑制率依次为(63.7±5.8)%、(92.7±8.8)%、(73.4±8.3)%.结论 荭草素和异荭草素对SGLT2 和α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制活性,对PTP1B几乎没有抑制作用,且荭草素的体外活性略强于异荭草素,荭草素有可能作为一类具有双靶点作用的降血糖药物的先导化合物.

黑曲霉是有机酸与酶制剂重要的工业生产菌株,具有强大的水解酶系与葡萄糖转运系统,可快速响应胞外碳源变化,摄取环境中葡萄糖供给细胞生长和产物合成.作为重要的碳源底物与关键的信号分子,葡萄糖的摄取吸收直接影响黑曲霉细胞生长与发酵性能.针对目前丝状真菌缺乏简便葡萄糖吸收能力定量表征方法的问题,本文以 2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑-4-氨基)-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)作为葡萄糖吸收探针,通过将预培养的黑曲霉孢子与 2-NBDG孵育后,利用荧光显微成像与流式细胞分析,建立了丝状真菌的葡萄糖吸收的定量检测方法.结果发现,2-NBDG 的最佳使用浓度为 150 μmol/L,最佳孵育时间为4 h.进一步利用该定量分析方法,发现低亲和力葡萄糖转运蛋白MstC的过表达使黑曲霉葡萄糖吸收提高 1.44 倍,同时在前期研究的基础上,利用多序列比对分析,设计了MstC的突变体R188K,通过检测发现该点突变可直接导致MstC葡萄糖转运活性的丧失,这表明Arg188 是影响MstC葡萄糖转运能力的关键氨基酸位点.本文葡萄糖摄取定量检测方法的建立及其在MstC功能研究上的应用,不仅加深了丝状真菌葡萄糖吸收的定量认识,也为葡萄糖转运系统的改造优化提供了技术支撑.

目的 通过网络药理学与实验验证相结合的方法探究补骨脂乙素治疗 2 型糖尿病的作用机制.方法 使用ECTM、SwissTargetPrediction、PubChem数据库预测补骨脂乙素的作用靶点,使用 GeneCards数据库预测 2 型糖尿病的潜在靶点.使用Venn数据库进行靶点交互分析,通过STRING数据库计算蛋白相互网络关系(PPI),通过Cytoscape 3.9.1 插件MCODE和Cytohubba筛选核心靶点.通过DAVID数据库进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)途径的富集分析.建立胰岛素抵抗的HepG2 细胞模型,通过 2-NBDG检测细胞对葡萄糖摄取的能力,通过RT-PCR和Western blotting检测网络药理学预测的磷脂肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关mRNA及蛋白表达.结果 补骨脂乙素和 2 型糖尿病共同作用的基因 92 个,PPI网络(交互得分≥0.150)包含补骨脂乙素和 2 型糖尿病共同目标的 86 个节点和379 个"边".在MCODE和Cytohubba的筛选结果交叉后,获得了 35 个共同靶点.聚类分析表明,补骨脂乙素作用于 2型糖尿病涉及PI3K/Akt信号通路等多种途径及细胞氧化还原反应等多种细胞进程.补骨脂乙素显著增强了胰岛素抵抗细胞对葡萄糖的摄取能力(P＜0.05、0.01).与模型组相比,补骨脂乙素处理后显著增加了胰岛素受体(INS-R)、胰岛素受体底物1(IRS1)、葡萄糖转运蛋白 2(GLUT2)、PI3K、Akt mRNA的表达(P＜0.01、0.001).与模型组相比,二甲双胍组和补骨脂乙素组的INS-R、IRS1、GLUT2、Akt、PI3K、p-Akt、p-PI3K的蛋白表达显著上调(P＜0.05、0.01、0.001).结论 补骨脂乙素可能通过PI3K/Akt信号通路增加胰岛素抵抗细胞对葡萄糖的摄取能力,发挥其抗 2 型糖尿病作用.

目的 研究二氢姜黄素对非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的预防作用与机制.方法 HepG2细胞经0.5 mmol/L油酸(OA)与二氢姜黄素(0、5、10、20 μmol/L)同时处理24 h后,检测细胞内三酰甘油(TG)、活性氧自由基(ROS)、一氧化氮(NO)含量以及细胞对荧光D-葡萄糖同系物(2-NBDG)的摄取能力;采用RT-qPCR和Western blotting方法检测细胞中糖脂代谢与氧化应激相关基因固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1C)、Patatin样磷酯酶结构域蛋3(PNPLA3)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(pAKT)、蛋白激酶B(AKT)和核转录因子Nrf2 (Nrf2)的mRNA与蛋白表达量.结果 与对照组相比,OA处理组细胞内TG、ROS及NO含量明显上升,对2-NBDG的摄取能力降低,SREBP-1C和PNPLA3的mRNA及蛋白表达上调,PPARα、PI3K、pAKT/AKT和Nrf2的蛋白表达下调;与OA处理组相比,OA+二氢姜黄素组细胞内TG与NO含量降低,对2-NBDG的摄取能力升高,SREBP-1C和PNPLA3的mRNA与蛋白表达下调,PPARα、PI3K和Nrf2的蛋白表达及pAKT/AKT上调.结论 二氢姜黄素对体外NAFLD细胞模型的预防作用机制包括:通过抑制脂合成关键基因(SREBP-1C和PNPLA3)及诱导脂氧化关键基因PPARα的表达,预防肝细胞脂堆积;通过上调PI3K的表达及pAKT/AKT水平,缓解胰岛素抵抗,促进肝细胞对葡萄糖的摄取;通过上调Nrf2的表达量,降低细胞内NO含量,缓解肝细胞的炎症反应及氧化损伤.