目的:探讨轴突导向因子3A（Sema3A）对脂多糖（LPS）诱导的CD4 +CD25 +调节性T细胞（Tregs）稳定性的作用及机制。 方法:采用体外免疫磁珠法分离和培养C57BL/6J小鼠脾脏CD4 +CD25 + Tregs，将分离的细胞按随机数字表法分为对照组（仅给予抗小鼠CD3e和CD28诱导细胞处于激活状态）、LPS组（在对照组的基础上给予LPS 100 μg/L）、LPS+核转录因子-κB（NF-κB）抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）组（给予LPS 100 μg/L+PDTC 25 mg/L）、LPS+磷酸盐缓冲液（PBS）组（给予LPS 100 μg/L+PBS 10 μL）、LPS+PDTC+重组Sema3A（rSema3A）组（给予LPS 100 μg/L+PDTC 25 mg/L+rSema3A 300 μg/L）和LPS+PBS+rSema3A组（给予LPS 100 μg/L+PBS 10 μL+rSema3A 300 μg/L）。各组培养24 h后，采用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫荧光法检测CD4 +CD25 + Tregs特异性标志物叉头翼状转录因子-3（Foxp-3）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）和膜相关转化型生长因子-β1（TGF-β1 m+）的基因及蛋白表达，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清液中白细胞介素-10（IL-10）和分泌型转化生长因子-β1（sTGF-β1）的水平，采用免疫荧光法检测细胞凋亡，采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测Foxp-3-Tregs特异性去甲基化区（Foxp-3-TSDR）的去甲基化程度，以反映CD4 +CD25 + Tregs的稳定性，采用电泳迁移率分析（EMSA）检测NF-κB信号通路的DNA结合活性，采用蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测NF-κB信号通路活性。 结果:与对照组比较，LPS能够增加细胞稳定性，表现为Foxp-3、CTLA-4和TGF-β1 m+的基因及蛋白表达上调，IL-10和sTGF-β1分泌增加，细胞凋亡减少，Foxp-3-TSDR去甲基化程度增加；同时LPS可增加细胞内NF-κB信号通路的DNA结合活性，以及主要分子NF-κB抑制蛋白激酶β（IKKβ）和p65的磷酸化水平，说明LPS增加细胞稳定性的机制与NF-κB信号通路有关。与LPS组比较，PBS并未对细胞稳定性和NF-κB信号通路产生影响；但添加rSema3A后能进一步增加细胞稳定性，并激活NF-κB信号通路。而PDTC能够抑制rSema3A增加细胞稳定性的功能，表现为：与LPS+PBS+rSema3A组比较，LPS+PDTC+rSema3A组Foxp-3、CTLA-4和TGF-β1 m+的基因及蛋白表达明显下调〔Foxp-3基因（2 -ΔΔCt）：8.092±1.117比18.509±1.068，Foxp-3蛋白（相对荧光强度）：1.224±0.033比1.826±0.181；CTLA-4基因（2 -ΔΔCt）：3.254±0.760比11.840±0.827，CTLA-4蛋白（相对荧光强度）：1.305±0.058比1.842±0.111；TGF-β1 m+基因（2 -ΔΔCt）：3.589±1.180比8.509±0.472，TGF-β1 m+蛋白（相对荧光强度）：1.319±0.033比1.822±0.063，均 P<0.01〕，IL-10和sTGF-β1分泌减少〔IL-10（ng/L）：445.33±54.08比992.67±83.10，sTGF-β1（ng/L）：1 116.67±65.25比1 494.67±94.45，均 P<0.01〕，细胞凋亡明显增加（荧光强度：0.398±0.031比0.268±0.046， P<0.01），Foxp-3-TSDR去甲基化程度明显降低（灰度值：0.467±0.048比1.780±0.119， P<0.01），NF-κB信号通路的DNA结合活性被明显抑制（灰度值：1.23±0.02比3.95±0.06， P<0.01），IKKβ和p65的磷酸化水平降低〔p-IKKβ表达（p-IKKβ/IKKβ）：0.97±0.07比1.97±0.04，p-p65（p-p65/p65）：0.95±0.08比1.93±0.06，均 P<0.01〕。 结论:LPS能通过NF-κB信号通路增加CD4 +CD25 + Tregs稳定性；Sema3A能够进一步增加CD4 +CD25 + Tregs稳定性，并且与NF-κB信号通路有关。

目的:研究探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC）能否通过抑制核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB, NF-κB）活化改善脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导的脓毒症大鼠炎症反应、心肌损伤并改善心功能。方法:采用随机数表法将33只健康SD大鼠随机分为对照组（ n=6）、PDTC+LPS组（ n=12）和LPS组（ n=15）。心脏多普勒超声检测存活大鼠心功能；ELISA检测血清中白介素-6（interleukin, IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）及心肌钙蛋白I（cardiac troponin I, cTnI）水平。苏木精-伊红染色显微镜下观察大鼠心肌组织形态学改变；IHC检测各组心肌组织中NF-κB p65的表达及核转位情况；Western blotting检测心肌组织IL-6、TNF-α、NF-κB p65及其磷酸化（p-NF-κB p65）水平。 结果:实验雄性SD大鼠造模7 h后，对照组、LPS组、LPS+PDTC组分别存活6只、8只、9只。与对照组相比，LPS组心肌组织中NF-κB p65磷酸化水平增加（ P<0.01），IL-6、TNF-α的蛋白表达增加（均 P<0.01），心肌细胞核上NF-κB p65阳性表达增加（ P<0.01），血清中IL-6、TNF-α、cTnI的水平增加（均 P<0.01）；心率、每搏输出量、射血分数、左室短轴缩短率、心输出量减少（均 P<0.05）；心肌组织出现不同程度水肿、出血、炎症细胞浸润甚至心肌纤维断裂等。与LPS组相比，PDTC+LPS组心肌组织中NF-κB p65磷酸化水平降低（ P<0.01），IL-6、TNF-α的蛋白表达减少（均 P<0.01），心肌细胞核上NF-κB p65阳性表达减少（ P<0.01），血清中IL-6、TNF-α、cTnI的水平减低（均 P<0.01）；每搏输出量、心率、射血分数、左室短轴缩短率、心输出量增加（均 P<0.05）；心肌组织的水肿、出血、炎症细胞浸润及心肌纤维断裂改善。 结论:PDTC能通过抑制NF-κB的活化减轻脓毒症大鼠炎症反应与心肌损伤，并改善心功能。NF-κB可能成为脓毒症治疗中新的靶点，为降低脓毒症心肌损伤发生率及病死率提供新的方向。

目的 观察吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)对二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)诱导肝纤维化大鼠肝组织核转录因子-κB (nuclear factor-κB,NF-κB)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及Ⅲ型胶原(collagen typeⅢ,Col-Ⅲ)表达的影响,探讨PDTC抗肝纤维化的可能机制.方法 22只SD大鼠随机分为对照组6只,模型组8只和治疗组8只.模型组和治疗组腹腔注射质量分数0.5％ DMN溶液2 mL/kg,每2d注射1次,连续4周,诱导大鼠肝纤维化模型;对照组腹腔注射等量生理盐水.治疗组造模期间给予PDTC溶液150 mg/(kg·d)灌胃,对照组、模型组给予等量蒸馏水灌胃.实验结束后处死大鼠,取肝左叶组织光镜下观察肝组织病理改变,采用电泳迁移率试验检测肝组织NF-κBp65活性,实时荧光定量PCR法检测肝组织NF-κBp65、TGF-β1和Col-ⅢmRNA表达,免疫组织化学法检测肝组织NF-κBp65着色细胞数目和Col-Ⅲ着色面积.结果 对照组肝小叶结构正常,细胞排列规律,未见肝细胞变性、坏死;模型组肝细胞融合性坏死,胶原纤维明显增生,假小叶形成;治疗组肝细胞肿胀、变性及炎症细胞浸润程度均较模型组轻;模型组、治疗组肝组织NF-κBp65活性[(76.6±6.5)％、(51.2±4.6)％],NF-κBp65 mRNA(0.019 3±0.005 0、0.009 5±0.002 1)、TGF-β1 mRNA(0.017 5±0.001 2、0.009 7±0.001 1)及Col-ⅢmRNA表达(0.077 5±0.030 5、0.030 1±0.003 3)均高于对照组((28.5±3.3)％、0.003 0±0.001 4、0.004 7±0.000 9、0.015 2±0.005 5)(P＜0.05),NF-κBp65着色细胞数目[(68.60±4.65)、(49.65±3.60)个]均较对照组[(14.68±2.98)个]多(P＜0.05),Col-Ⅲ着色面积[(10.39±1.53)、(7.36±1.17)μm2]均较对照组[(2.46±0.31)μm2]大(P＜0.05);模型组肝组织NF-κBp65活性,NF-κBp65 mRNA、TGF-β1mRNA及Col-ⅢmRNA表达均较治疗组高,NF-κBp65着色细胞数目较治疗组多,Col-Ⅲ着色面积较治疗组大(P＜0.05);Pearson相关分析结果显示,肝组织NF-κBp65活性与NF-κBp65 mRNA、TGF-β1 mRNA、Col-ⅢmRNA表达,NF-κBp65着色细胞数目,Col-Ⅲ着色面积均呈正相关(r=0.884,P＜0.001;r=0.976,P＜0.001;r=0.769,P＜0.001;r=0.934,P＜0.001;r=0.942,P＜0.001),TGF-β1 mRNA与Col-ⅢmRNA表达及Col-Ⅲ着色面积均呈正相关(r=0.831,P＜0.001;r=0.918,P＜0.001).结论 PDTC可能通过抑制NF-κB活性,下调TGF-β1表达,抑制以ColⅢ为主要成分的细胞外基质过度沉积,来发挥抗肝纤维化作用.

目的 探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)小鼠肺组织氧化应激及线粒体功能的影响.方法 按随机数字表法将40只雌性Balb/c小鼠分为生理盐水(NS)对照组、LPS模型组、PDTC组和PDTC+LPS组,每组10只.腹腔注射LPS 15 mg/kg诱导ALI小鼠模型;PDTC+LPS组于注射LPS前1 h腹腔注射PDTC 50 mg/kg进行预处理;NS对照组仅腹腔注射NS 0.1 mL,PDTC组仅腹腔注射PDTC 50 mg/kg.制模24 h后处死小鼠取肺组织,应用光谱光度测量工具测定肺组织总抗氧化能力(T-AOC),采用硫代巴比妥酸法测定肺组织丙二醛(MDA)含量,采用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测肺组织超氧化物歧化酶(SOD1、SOD2)和过氧化氢酶(CAT)的蛋白表达.分离肺组织线粒体,采用荧光素酶/荧光素测量方法测定线粒体三磷酸腺苷(ATP)含量,采用罗丹明法测定线粒体膜电位(ΔΨm),采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测线粒体解耦联蛋白(UCPs)的mRNA表达.结果 LPS刺激可明显加剧小鼠肺组织氧化应激水平,导致线粒体功能障碍,表现为肺组织T-AOC和SOD1蛋白表达降低,MDA水平升高,线粒体ATP合成减少,ΔΨm下降,UCP2 mRNA表达降低;而肺组织SOD2、CAT和线粒体UCP1、UCP3表达无明显变化.给予PDTC预处理可明显缓解LPS诱导的肺组织氧化应激水平升高,减轻线粒体功能障碍,与LPS模型组比较,肺组织T-AOC明显升高(U/g:0.35±0.08比0.31±0.07),MDA水平明显下降(μmol/mg:13.29±1.13比17.54±1.72),SOD1蛋白表达明显升高(SOD1蛋白:1.13±0.11比0.71±0.09),线粒体ATP合成明显增加(μmol/mg:49.23±5.42比36.92±2.21),ΔΨm明显升高(mV:226.03±11.69比194.86±7.79),UCP2 mRNA表达明显升高(2-ΔΔCt:0.88±0.06比0.73±0.04),差异均有统计学意义(均P<0.05).此外,PDTC单独处理对正常小鼠肺组织也有抗氧化、减轻氧化应激、促进线粒体ATP合成的作用,与NS对照组比较,肺组织T-AOC明显升高(U/g:0.49±0.09比0.43±0.06),MDA明显下降(μmol/mg:10.27±1.25比12.17±1.36),SOD2和CAT蛋白表达明显升高(SOD2蛋白:1.33±0.08比1.00±0.11,CAT蛋白:1.39±0.08比1.00±0.11),线粒体ATP合成明显增加(μmol/mg:61.53±4.92比53.33±3.20),差异均有统计学意义(均P<0.05);但对肺组织SOD1蛋白表达及线粒体ΔΨm和UCPs mRNA表达无明显影响.结论 LPS可诱导ALI小鼠肺组织氧化应激,并通过抑制ATP合成导致线粒体功能障碍;PDTC预处理对LPS诱导的ALI小鼠肺组织有抗氧化作用,可减轻线粒体功能障碍.

免疫性肝病是临床上难治性疾病,目前没有特效性药物,因此,研发新的有效干预药物,对防治免疫性肝病有重要的临床价值.为探讨青蒿琥酯(artesunate,Art)对免疫性肝损伤的保护作用,该研究采用不同质量浓度(27,54,108 mg·kg-1)Art灌胃小鼠连续7 d,然后尾静脉注射伴刀豆球蛋白A(concanavalin A,Con A)诱导小鼠肝损伤模型.于造模后8 h采血液和肝组织进行血清转氨酶(ALT,AST)、组织病变、炎性细胞因子以及NF-κB关键蛋白表达水平的检测.结果表明,与模型组相比,Art高浓度组显著降低了模型小鼠的肝指数、ALT和AST水平(P<0.01),组织病变也明显减轻,同时降低了促炎细胞因子TNF-α,IFN-γ,IL-6,IL-17的水平而增加了炎性抑制因子IL-10的表达(P<0.05),并呈现明显的剂量-效应关系.Western blot法检测结果显示108 mg·kg-1 Art可显著抑制NF-κB关键蛋白p-p65和p-IκBα的表达(P<0.01).NF-κB特异阻断剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)也可显著抑制p-p65和p-IκBα表达并减轻肝损伤.以上结果说明Art主要通过抑制NF-κB信号通路而对ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤发挥保护作用.该研究为青蒿琥酯用于自身免疫性肝损伤的防治提供了参考.

目的 探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)治疗急性胰腺炎( AP)大鼠的效果及其作用机制.方法 SPF级SD大鼠72只随机分为假手术组、模型组、PDTC组各24只,PDTC组于建模前腹腔注射30 mg/kg的PDTC,假手术、模型组给予等量的生理盐水;分别于造模后24、48、72 h对血清高迁移率族蛋白(HMG)B1、丙二醛(MDA)、白细胞介素(IL)-1、淀粉酶(AMY)水平进行检测,并采用Western印迹法检测3组胰腺组织中胰腺组织核因子(NF)-κB、HMGB1蛋白表达.结果 造模后24、48及72 h,模型组、PDTC组血清HMGB1、MDA、IL-1、AMY水平均显著高于假手术组(P<0. 05);造模后24、48 及72 h,PDTC组血清HMGB1、MDA、IL-1、AMY水平均显著低于模型组(P<0. 05);造模后24、48及72 h,模型组、PDTC组胰腺组织中NF-κB蛋白、HMGB1蛋白相对表达强度均显著高于假手术组(P<0. 05);造模后24、48及72 h,PDTC组胰腺组织中NF-κB蛋白、HMGB1蛋白相对表达强度均显著低于模型组(P<0. 05).结论 PDTC治疗AP大鼠能显著减轻炎症反应程度、降低胰腺组织中NF-κB蛋白、HMGB1蛋白表达,从而达到治疗目的.

目的 探讨血管紧张素(Ang)Ⅱ是否能通过核因子(NF)-κB途径调节巨噬细胞移动抑制因子(MIF)mRNA的表达.方法 佛波酯诱导THP-1细胞48 h并使其转化为巨噬细胞,用CD68进行免疫细胞化学鉴定.第一组:对照组、AngⅡ1×10-8 mol/L组、AngⅡ1×10-7 mol/L组、AngⅡ1×10-6 mol/L组、AngⅡ1×10-5 mol/L组.第二组:对照组、AngⅡ(1×10-6 mol/L)组、AngⅡ(1×10-6 mol/L)+吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(PDTC)组、PDTC组.Western印迹方法检测第一组细胞核内NF-κB的表达.Re-al time RT-PCR方法检测第二组巨噬细胞MIF mRNA的表达.结果 Western印迹随着AngⅡ浓度的升高,NF-κBp65的表达逐渐增强.Real time RT-PCR:AngⅡ组MIF mRNA表达明显高于对照组;给予NF-κB特异性抑制剂PDTC后,由AngⅡ诱导的MIF mRNA表达明显降低.结论 AngⅡ能通过NF-κB信号通路促进巨噬细胞MIF mRNA的表达.

目的 探讨川崎病中外周血核因子-κB(NF-κB)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9),以及炎症因子的表达及意义.方法 选取2015年1月至2016年1月在十堰市人民医院治疗的急性期川崎病患儿30例(KD组),同时选取正常小儿20例作为健康对照组,培养2组外周血单个核细胞(PBMCs),同时将KD组外周血PBMCs分为佛波酯组(PMA组)(20 nmol/L PMA),PMA+吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)组(在PMA基础上增加100 mol/L PDTC)和空白对照组(不作任何干预),采用免疫组化法检测NF-κB活化水平,ELISA法检测MMP-9、白细胞介素(IL)-6和IL-7水平.结果 KD组NF-κB活化水平、MMP-9、IL-6和IL-7分别为(50.33±12.18)％、(904.18±83.20)ng/ml、(445.28±93.29)pg/ml和(36.81±9.43)pg/ml,明显高于健康对照组,差异有统计学意义(P<0.05);PMA组NF-κB活化水平、MMP-9、IL-6和IL-7明显高于空白对照组(P<0.05);PMA+PDTC组NF-κB活化水平、MMP-9、IL-6和IL-7较PMA组明显降低(P<0.05);KD组患儿NF-κB活化水平与IL-6和IL-7呈正相关(r=0.452和0.447,P<0.05);MMP-9与NF-κB活化水平、IL-6和IL-7无相关性(P>0.05).结论 KD患儿外周血PBMCs中MMP-9表达增强以及NF-κB活化在KD免疫性血管损伤中有重要作用,可为该病诊断、治疗、预后评估提供一定参考依据.

目的:探讨吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)对急性CO中毒迟发性脑病(DEACMP)大鼠海马区NF-κB和C-myc表达水平的调控及对神经细胞凋亡的影响.方法:按照随机数字表法将经水迷宫实验筛选后的150只成年健康SD雄性大鼠分为空气对照组(NC组),CO中毒组(CO组),CO中毒+PDTC组(PCO组),每组50只.采用分次腹腔注射纯品CO气体法制备DEACMP大鼠模型,PCO组于首次注射CO气体后0.5 h腹腔注射PDTC稀释液,1次/d,直到处死.于染毒后1 d、3 d、7 d、14 d、21 d,从三组中分别选取10只大鼠,采用Morris水迷宫实验验证大鼠学习记忆能力,免疫荧光法检测海马CA1区NF-κB和C-myc蛋白的动态表达情况,苏木精-伊红染色及TUNEL荧光染色检测海马CA1区的细胞凋亡情况.结果:与NC组对比,染毒后14～21 d CO组逃避潜伏期明显延长(P<0.01),穿越平台次数显著减少(P<0.01);CO组海马CA1区NF-κB和C-myc蛋白表达增多(P<0.05),在染毒后1 d即明显升高,于染毒后3～7 d达峰值(P<0.05);CO组海马CA1区神经细胞凋亡明显(P<0.05),在染毒后7 d达高峰(P<0.05).PCO组大鼠行为学改变介于NC组和CO组之间,海马CA1区NF-κB、C-myc蛋白表达和细胞凋亡在染毒3 d以后较CO组明显减少(P<0.05),但仍高于NC组(P<0.05).结论:NF-κB、C-myc持续过量表达可加剧急性CO中毒所致的神经细胞凋亡,PDTC通过阻断NF-κB信号通路,减少凋亡因子C-myc的表达,减轻海马CA1区神经元损伤,从而达到改善DEACMP大鼠认知功能障碍的作用.

目的 探讨冻融治疗后库普弗细胞(KCs)的分泌功能对肝癌细胞的影响及其变化机制.方法 将实验分为16组:37℃对照组、三组低温组(0℃、5℃、10℃)、冻融坏死物质组和三组联合刺激组及以上每组分别设置一个平行组.8个平行组分别加入吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC),终浓度为100μmol/ml.ELISA法测定16组KCs上清液中能反映KCs分泌功能的TNF-α、IL-1β和INF-γ的浓度,Western blot检测各组NF-κB蛋白的表达.结果 低温和冻融坏死物质联合刺激KCs后,炎性因子TNF-α、IL-1β和IFN-γ的分泌增加(P<0.01),三组低温(0℃、5℃、10℃)与冻融坏死物质联合刺激均表现出叠加效应.低温刺激对NF-κB蛋白的表达无显著影响(P>0.05),联合刺激组和冻融坏死物质组NF-κB蛋白表达明显上调(P<0.05).NF-κB抑制剂处理后,8组平行组间NF-κB蛋白的表达和炎性因子的分泌水平无明显变化(P>0.05).TNF-α、IL-1β和INF-γ浓度与KCs上清液中NF-κB蛋白表达呈正相关(r=0.870,P=0.000).结论 冻融治疗可增强KCs分泌细胞因子的功能,在一定程度上可以诱导炎性反应进而达到清除肿瘤细胞的目的,KCs的分泌功能可能通过NF-κB信号通路发挥作用.