目的:探讨着丝粒蛋白F(centromere protein F,CENPF)在腺样囊性癌(adenoid cystic carcinoma,ACC)发生发展中的作用和分子机制.方法:通过小干扰RNA转染敲低ACC细胞中的CENPF.通过细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)、划痕实验和Transwell测定评估敲低CENPF对ACC细胞增殖、迁移、侵袭的影响;通过蛋白免疫印迹实验分析改变CENPF表达后ACC细胞中磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路相关蛋白表达变化,通过CCK-8、划痕实验和Transwell测定评估敲低CENPF联合PI3K抑制剂BKM-120对ACC细胞增殖、迁移、侵袭的影响.结果:敲低ACC-M中CENPF表达后,CCK-8实验证明其增殖能力减弱;划痕实验表明其迁移能力减弱,Transwell实验表明其侵袭能力减弱,PI3K/AKT通路关键蛋白p-PI3K、p-AKT和p-mTOR蛋白表达水平下降.在下调CENPF的ACC-M中加入PI3K抑制剂,PI3K/AKT通路关键蛋白表达水平进一步下降.此外,加入PI3K抑制剂后,CENPF下调的ACC-M增殖、迁移、侵袭能力较单纯下调CENPF的ACC-M进一步减弱.结论:CENPF通过调控PI3K/AKT信号通路参与ACC进展.

目的 构建人源R-spondin 2(roof plate-specific spondin 2,RSPO2)的真核表达载体,表达、纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切除Fc结构域后,检测RSPO2-Fu的生物学活性.方法 基于生物信息学方法分析人源RSPO2蛋白的理化性质和结构,筛选获得可在溶液中稳定存在的RSPO2截短蛋白RSPO2-Fu.将编码RSPO2-Fu蛋白的基因亚克隆至pCMV-Fc载体后,将质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc瞬时转染入HEK293F细胞中表达72 h,通过Protein A层析柱纯化融合蛋白RSPO2-Fu-Fc,用3C蛋白酶切去Fc结构域,分子筛进一步提纯获得RSPO2-Fu蛋白.最后,通过M50 Super 8 × TOPFlash检测RSPO2-Fu蛋白的生物学活性.结果 生物信息学分析结果显示,RSPO2全长有243个氨基酸,相对分子质量为28 300,等电点为9.42,为亲水性不稳定蛋白,RSPO2-Fu截短蛋白在溶液中的稳定性得到了极大提高;重组表达质粒pCMV-RSPO2-Fu-Fc经菌落PCR及测序证明构建正确;获得了纯度达95％的RSPO2-Fu蛋白;生物学活性检测结果显示,RSPO2-Fu的EC5.值为1.5× 10-12 mol/L.结论 对RSPO2蛋白适当截短后,可获得稳定表达的RSPO2-Fu蛋白,其对Wnt信号通路有明显激活作用,为Wnt信号通路中RSPO2相关生物学研究提供了更好的参考.

谷氨酸(glutamic acid,Glu)为哺乳动物体内一种重要的兴奋性神经递质,其受体分为离子型和代谢型,广泛分布于神经元和非神经元细胞上,调节大脑、脊髓、视网膜和周围神经系统[1].

目的 探讨扁蒴藤素(PM)对骨肉瘤细胞阿霉素(ADM)耐药性的影响及其作用机制.方法 采用ADM浓度梯度递增长期培养法在体外建立ADM耐药细胞MG-63/ADR,CCK-8检测不同浓度ADM对骨肉瘤细胞MG-63和MG-63/ADR细胞活力的影响,验证ADM耐药性;随后将MG-63/ADR细胞随机分为MG-63/ADR组(正常培养)、PM低剂量组(加入0.5 μmol/L PM)、PM中剂量组(加入1.0 μmol/L PM)、PM高剂量组(加入2.0 μmol/L PM),CCK-8检测不同浓度ADM处理下各组细胞活力;平板克隆形成实验检测各组细胞对ADM的敏感性;显微镜下观察细胞形态;流式细胞术检测细胞凋亡水平;Western blot检测磷酸化哺乳动物STE20样蛋白激酶1(p-MST1)、MST1、磷酸化大肿瘤抑制因子1(p-LATS1)、LATS1、磷酸化Yes相关蛋白(p-YAP)、YAP蛋白表达.结果 25、125、625、3 125、15 625 ng/mL ADM干预下,MG-63/ADR细胞活力较MG-63细胞显著升高(P＜0.05),说明ADM耐药细胞模型建立成功.与MG-63/ADR组相比,PM低、中、高剂量组细胞数量减少且细胞逐渐皱缩、间距变大,细胞活力、细胞克隆形成率以及p-YAP/YAP水平下降(P＜0.05),细胞凋亡率和p-MST1/MST1、p-LATS1/LATS1水平显著提高(P＜0.05).结论 PM对骨肉瘤细胞ADM耐药性具有抑制作用,其可能与激活Hippo通路、下调YAP信号有关.

目的 观察吲哚-3-甲醇(I3C)对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的作用.方法 采用0.2％Ⅰ型胶原酶消化分离SD大鼠PASMCs,以低氧(1％O2)作为诱导剂,建立PASMCs增殖的细胞模型,以不同浓度的I3C(25、50、100、200 μmol·L-1)干预24h,检测细胞增殖及存活率;设置哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂rapamycin或缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)抑制剂LW6为阳性对照组,以100 μmol·L-1 I3C,HIF-1α稳定剂DMOG或mTOR激活剂MHY1485干预24 h后,CCK-8试剂盒检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞周期;Western blot检测HIF-1α、总的mTOR及磷酸化的mTOR和细胞周期调控相关蛋白的表达,确定I3C抑制PASMCs增殖的作用机制.结果 25～100μmol·L-1 I3C抑制低氧诱导的PASMCs增殖的作用具有浓度依赖性(P＜0.05),而100 μmol·L-1与200 μmol·L-1 I3C抑制细胞增殖的作用无明显差异,且I3C无明显细胞毒性作用.I3C(100 μmol·L-1)与LW6均可抑制低氧诱导的PASMCs增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制HIF-1α、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cyclin E、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2、CDK4和CDK6的表达(P＜0.05),且DMOG能够逆转I3C的上述作用(P＜0.05).另外I3C与rapamycin在抑制低氧诱导的PASMCs增殖与mTOR/HIF-1α信号通路活化方面作用相似,且MHY1485能够逆转I3C抑制细胞增殖及mTOR/HIF-1α信号通路活化的作用(P＜0.05).结论 I3C可通过抑制mTOR/HIF-1α信号通路减弱低氧诱导的PASMCs增殖.

目的 探究益气通脉方对载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠脉粥样硬化(AS)的影响及机制.方法 将40只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、阳性对照组[阿托伐他汀钙,2.6mg/(kg·d)]和益气通脉方低、中、高剂量组[0.46、0.91、1.82 g/(kg·d),以生药量计],每组8只;另取C57BL/6J小鼠8只作为正常组.除正常组外,其余各组小鼠给予高脂饲料并灌胃相应药液或生理盐水,每天1次,连续12周.末次给药后,检测小鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平及肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)含量;检测并计算各组小鼠主动脉斑块面积占比,观察主动脉窦病理形态学变化;检测小鼠主动脉中磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(又称Akt)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平.结果 与模型组比较,益气通脉方中、高剂量组小鼠血清TC、TG、LDL-C水平和TNF-α、IL-1β、MCP-1(含低剂量组)含量均显著降低,高剂量组的HDL-C含量显著升高(P＜0.05或P＜0.01);益气通脉方各剂量组小鼠主动脉斑块均有不同程度减少,脂质沉积、炎症细胞浸润等病理改变均有不同程度减轻;益气通脉方中、高剂量组小鼠主动脉斑块面积占比和主动脉中PI3K、Akt、mTOR蛋白的磷酸化水平均显著降低(P＜0.05或P＜0.01).结论 益气通脉方可改善AS小鼠的脂质代谢,减轻炎症反应,延缓斑块发展,其作用可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路激活有关.

目的:探讨和厚朴酚对脂多糖诱导心肌细胞损伤、自噬和凋亡的影响及潜在作用机制.方法:以10 μg/mL脂多糖作用H9C2细胞建立心肌细胞损伤模型,分为空白对照组、模型对照组、和厚朴酚12.5、25.0、50.0 μmol/L组和和厚朴酚50.0 μmol/L+3-MA(自噬抑制剂3-MA 10 mmol/L)组.CCK-8法检测细胞活力;ELISA法检测炎性因子水平;DCFH法测活性氧(ROS)水平;LC3免疫荧光染色观察自噬;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot法检测与自噬、凋亡及PI3K/AKT/mTOR通路相关的蛋白表达.结果:与空白对照组比较,模型对照组细胞活力降低,LAMP2蛋白表达显著下调(P＜0.01),而炎症因子含量、ROS水平、自噬细胞数量、细胞凋亡率显著增加,LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1、P62、Cleaved caspase 3/Caspase 3、p-PI3K/PI3K 和 p-AKT/AKT 的蛋白表达均显著上调(P＜0.01);与模型对照组相比,和厚朴酚可明显降低炎症因子含量、ROS水平、细胞凋亡率、P62表达,下调Cleaved caspase 3/Caspase 3蛋白表达及PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达(P＜0.01),提高细胞活力、自噬细胞数量及上调LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1和LAMP2蛋白表达(P＜0.01),且和厚朴酚对细胞活力、炎症因子水平、ROS水平、自噬细胞数量和细胞凋亡率的调节均呈浓度依赖性;与和厚朴酚50.0 μmol/L组相比,和厚朴酚50.0 μmol/L+3-MA组的炎症因子含量、ROS水平、细胞凋亡率显著升高,P62和Cleaved caspase 3/Caspase 3蛋白表达显著上调(P＜0.01),细胞活力、自噬细胞数量显著降低,LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1、LAMP2、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的蛋白表达明显下调(P＜0.05或P＜0.01).结论:和厚朴酚可激发自噬,减少脂多糖诱导的心肌细胞损伤、ROS水平和细胞凋亡率,且效应与药物浓度成正相关,这些作用可能与和厚朴酚抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,上调自噬、促进自噬流有关.

目的 探讨高良姜素调节沉默信息调节因子 1(SIRT1)/增强腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的大鼠关节软骨细胞自噬和凋亡的影响.方法 将大鼠关节软骨细胞分为对照组,模型组(1.0 μg·mL-1 LPS),高良姜素低(1.0 μg·mL-1 LPS+10 μmol·L-1 高良姜素)、中(1.0 μg·mL-1 LPS+20 μmol·L-1 高良姜素)、高(1.0 μg·mL-1 LPS+40 μmol·L-1 高良姜素)剂量组,高良姜素高剂量+EX527(SIRT1 抑制剂)组(1.0 μg·mL-1 LPS+40 μmol·L-1 高良姜素+40 μmol·L-1 EX527).用流式细胞术检测关节软骨细胞凋亡;丹酰尸胺(MDC)染色观察关节软骨细胞自噬;酶联免疫吸附法检测细胞中白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6 水平;Western Blot法检测苄氯素(Beclin)、微管相关蛋白 1 轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ、B 淋巴细胞瘤-2 相关 X 蛋白(Bax)、B 淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、SIRT1、AMPK、磷酸化AMPK(p-AMPK)、mTOR、p-mTOR表达情况.结果 与对照组比较,模型组MDC阳性细胞比例,Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1 蛋白表达及p-AMPK/AMPK比值均降低(P＜0.05);细胞凋亡率、IL-1β、TNF-α、IL-6 水平、Bax蛋白表达、p-mTOR/mTOR比值均升高(P＜0.05).与模型组比,高良姜素低、中、高剂量组的MDC阳性细胞比例及Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1 蛋白表达及p-AMPK/AMPK比值均增加(P＜0.05);细胞凋亡率、IL-1β、TNF-α、IL-6 水平、Bax蛋白表达及p-mTOR/mTOR比值均降低(P＜0.05).与高良姜素高剂量组比较,高良姜素高剂量+EX527 组的MDC阳性细胞比例及Beclin、LC3Ⅱ/Ⅰ、Bcl-2、SIRT1 蛋白表达以及 p-AMPK/AMPK 比值明显降低(P＜0.05),细胞凋亡率 IL-1 β、TNF-α、IL-6 水平、Bax 蛋白表达、p-mTOR/mTOR比值明显升高(P＜0.05).结论 高良姜素能促进LPS诱导的关节软骨细胞自噬,抑制细胞凋亡,可能是通过激活SIRT1/AMPK/mTOR信号通路发挥作用.

目的:探讨谷氨酰胺对经烧伤大鼠血清（以下简称烧伤血清）干预的大鼠心肌细胞的作用及其细胞信号机制。方法:采用实验研究方法。取10只7~8个月龄雌雄各半Wistar大鼠制备正常大鼠血清（以下简称正常血清），另取20只7~8个月龄雌雄各半Wistar大鼠造成30%体表总面积Ⅲ度烧伤后制备烧伤血清，从180只1~3 d龄雌雄不拘Wistar大鼠心尖组织中分离培养原代心肌细胞用于后续实验。按随机数字表法（分组方法下同）将细胞分为正常血清组、烧伤血清组，加入相应血清培养。分别于培养1、3、6、9、12 h，采用锥虫蓝实验检测细胞存活率。将细胞分为单纯烧伤血清组、烧伤血清+4 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+8 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组，采用单纯烧伤血清或烧伤血清+相应终物质的量浓度谷氨酰胺处理，培养前实验筛选出的干预时间，同前检测细胞存活率。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组，同前处理后采用蛋白质印迹法检测培养30 min哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）、p70核糖体蛋白S6激酶（p70 S6K）和真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）磷酸化水平。将细胞分为正常血清组、单纯烧伤血清组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺+25 ng/mL雷帕霉素组，行相应处理后，分别于培养1、3、6 h，采用免疫荧光法检测热休克蛋白70（HSP70）和金属硫蛋白（MT）表达并观测微管形态。各组各时间点各指标样本数均为10。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD- t检验、LSD检验及Bonferroni校正。 结果:培养1、3、6、9、12 h，烧伤血清组细胞存活率均明显低于正常血清组（ t=4.950、16.752、35.484、34.428、27.781， P<0.01）。与组内培养1 h比，烧伤血清组培养3、6、9、12 h细胞存活率明显降低（ P<0.05）；与组内培养3 h比较，烧伤血清组培养6、9、12 h细胞存活率明显降低（ P<0.05）；与组内培养6、9 h比较，烧伤血清组培养12 h细胞存活率明显降低（ P<0.05）；烧伤血清组培养6、9 h细胞存活率比较，差异无统计学意义（ P>0.05）。因此选择培养6 h作为后续烧伤血清干预时间。培养6 h，与单纯烧伤血清组比较，烧伤血清+4 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+8 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组细胞存活率均明显升高（ P<0.01）。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组与烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组细胞存活率相近（ P>0.05），烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组与烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组细胞存活率相近（ P>0.05）。因此选择12、16、20 mmol/L作为后续谷氨酰胺的干预浓度。培养30 min，正常血清组、单纯烧伤血清组、烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组、烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组细胞mTORC1、p70 S6K、4E-BP1磷酸化水平分别为1.001±0.042、0.510±0.024、0.876±0.022、0.836±0.074、0.856±0.041，1.00±0.11、0.38±0.09、0.95±0.13、0.96±0.13、0.89±0.24，1.00±0.07、0.29±0.08、0.87±0.27、0.68±0.08、0.60±0.21。与正常血清组比较，其余4个烧伤血清组细胞mTORC1、p70 S6K、4E-BP1磷酸化水平均明显降低（ P<0.01） 。与单纯烧伤血清组比较，其余3个烧伤血清组细胞mTORC1、p70 S6K、4E-BP1磷酸化水平均明显升高（ P<0.01）。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组细胞4E-BP1磷酸化水平明显高于烧伤血清+16 mmol/L谷氨酰胺组和烧伤血清+20 mmol/L谷氨酰胺组（ P<0.05）。单纯烧伤血清组细胞培养1 h MT表达明显低于正常血清组（ P<0.05），其余时间点MT表达明显高于正常血清组（ P<0.01）；培养1、3、6 h，单纯烧伤血清组细胞HSP70表达明显高于正常血清组（ P<0.05），烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组细胞HSP70和MT表达均明显高于单纯烧伤血清组（ P<0.05），烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺+25 ng/mL雷帕霉素组细胞HSP70和MT表达均明显低于烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组（ P<0.01）。正常血清组细胞培养1、3、6 h微管结构完整，呈网格排列，染色均匀。单纯烧伤血清组细胞培养1 h部分微管出现断裂，部分网格排列不齐；培养3 h靠近细胞核微管结构清晰，细胞核远端微管模糊不清；培养6 h微管结构模糊不清。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺组细胞培养各时间点微管破坏程度较单纯烧伤血清组轻。烧伤血清+12 mmol/L谷氨酰胺+25 ng/mL雷帕霉素组细胞培养各时间点微管形态与单纯烧伤血清组相近。 结论:烧伤血清可导致大鼠心肌细胞受损，细胞存活率明显下降。谷氨酰胺通过调控mTOR/p70 S6K/4E-BP1信号通路，促进心肌细胞HSP70和MT表达，稳定微管结构，从而发挥其细胞保护作用。

机械敏感性离子通道是细胞表面机械力学刺激转化为细胞内电信号或化学信号的机械感受器。近年来，在真核生物中Piezo蛋白作为机械敏感性阳离子通道逐渐成为研究热点，Piezo1和Piezo2蛋白在哺乳动物不同器官和组织中表达，而骨关节等组织与力学传导直接相关，机械力的传导及引起的细胞内效应对骨科疾病的治疗和预防起着非常重要的作用。就Piezo蛋白机械敏感性离子通道在骨组织、软骨组织、骨髓组织、椎间盘组织以及在骨科疾病中的研究进展进行综述。