目的:建立能够准确鉴别诃子、绒毛诃子及其混伪品的分子鉴定方法.方法:对诃子、绒毛诃子及其混伪品的新鲜果实进行烘干,观察其干燥前后的形态;提取样品DNA,采用DNA条形码内转录间隔区 2(ITS2)序列和psbA-trnH序列进行聚合酶链式反应扩增并测序,采用DANMAN 7、MAGE 6 软件对测序结果进行序列比对,计算Kimura 2-paramete遗传距离,并构建邻接法系统发育树.结果:形态观察发现,诃子、绒毛诃子果实干燥前后与混伪品有较大的差异,可以通过形态差异进行鉴别;DNA条形码序列表明,诃子和绒毛诃子ITS2 序列基本一致,仅发现 4 个单核苷酸多态性位点,但不能由此对两者进行区分;诃子和绒毛诃子的psbA-trnH序列存在 2 处明显差异,可对两者进行准确区分;绒毛诃子中存在 2 种类型的单倍型,其明显差异在于是否在psbA-trnH序列上存在 1 段 16 bp的串联重复序列;混伪品与诃子、绒毛诃子之间具有较大的psbA-trnH序列差异,可直接在美国国家生物技术信息中心比对进行区分;对市场上流通的诃子炮制品进行鉴定发现,其多为 2 种单倍型绒毛诃子,且存在毛诃子混伪的情况.结论:利用psbA-trnH序列可准确鉴别诃子、绒毛诃子及其混伪品,发现绒毛诃子中存在 2种类型的单倍型.

镰刀菌(Fusarium spp.)和根结线虫(Meloidogyne spp.)都是植物的重要病原物,这两种病原物在寄主植物中存在着非常复杂的互作关系,可导致严重的植物土传病害.为探寻对番茄根结线虫病害具有高效防治作用的优良菌株,本研究以禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)为靶标病菌,采用平板稀释涂布法从多年种植番茄的设施大棚土壤中分离和筛选到一株抑菌效果较好的生防细菌菌株TMQ-KSL-1,根据形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因测序对该菌株进行鉴定;测定不同浓度的发酵液及发酵上清液对根结线虫卵孵化率以及根结线虫二龄幼虫死亡率的影响,通过盆栽实验分析其发酵液对根结线虫病害的防治效果.结果表明,菌株TMQ-KSL-1具有较强的杀线虫活性,其发酵液和发酵上清液处理48 h线虫卵孵化抑制率分别为94.76％和90.72％;处理24 h番茄根结线虫二龄幼虫的校正死亡率分别为100％和97.37％;菌株TMQ-KSL-1发酵液100倍稀释液、200倍稀释液对番茄根结线虫病害防治效果分别为59.54％和12.14％,且100倍液处理防效与阿维菌素500倍液处理防效(61.56％)相当;地下鲜重分别提高了 90.95％、19.65％.因此,菌株TMQ-KSL-1具有防控番茄根结线虫病害的能力,具有市场开发应用前景.

物种基原是影响蟾酥药材质量的重要因素之一,来源于中华大蟾蜍的蟾酥质量显著高于来源于黑眶蟾蜍的蟾酥.蟾酥属于分泌物,缺乏基原动物的外观形态,传统鉴别法难以鉴别,而分子鉴定技术的快速发展为蟾酥鉴定提供了新的方法.然而,分泌物中残留的DNA 含量很少,降解严重,目前对分泌物来源的药材进行分子鉴定研究仍缺乏.为了解蟾酥药材的基原物种,该研究首先收集了83 份蟾酥样品,其中71 份原动物样品,按照2020 年版《中国药典》的方法制备蟾酥,市售蟾酥药材7 份,对照药材 5 份.然后比较了不同DNA提取方法,扩增其线粒体 16S rRNA基因片段和构建系统发育树,最后对蟾酥的基原物种进行分子鉴定.结果表明,试剂盒法提取蟾酥DNA质量比较好,83 份蟾酥样品中有 80 份成功扩增出 16S rRNA序列.从GenBank上下载了 71 条蟾酥基原物种的 16S rRNA序列.系统发育树结果表明蟾酥基原物种中华大蟾蜍与黑眶蟾蜍各自聚成单系,节点支持率为 100%(NJ)和 1.00(BI).市售蟾酥和对照药材的基原物种均为中华大蟾蜍.可见,从分泌物来源的蟾酥能提取DNA,扩增出 16S rRNA基因序列,能够对蟾酥基原物种进行分子鉴定,这为蟾酥药材的质量标准、其他分泌物来源的药材基原物种鉴定提供参考.

[背景]草地早熟禾(Poa pratensis)是一种被广泛使用的兼具观赏性和设施性的冷季型草坪草,白粉病的发生严重降低了草地早熟禾的质量和使用年限.[目的]对山西农业大学温室草地早熟禾白粉病病原物进行分离、纯化、鉴定和致病力分析,为草地早熟禾白粉病的防治提供理论依据.[方法]采用形态特征观察、核糖体内源转录间隔区(ribosomal DNA internally transcribed spacer,rDNA-ITS)序列分析进行分离株 BGP(TG)的鉴定;通过分生孢子密集抖落接种法测定BGP(TG)对 23 份草地早熟禾材料的致病力.[结果]草地早熟禾白粉菌分离株BGP(TG)分生孢子串生、无色、椭圆形,长和宽分别为(23.31-34.67)μm和(11.33-15.77)μm,成熟吸器为指状;rDNA-ITS序列分子发育分析结果表明分离株BGP(TG)与禾布氏白粉菌早熟禾专化型(Blumeria graminis f.sp.poae)聚于同一分支;BGP(TG)对 23 份草地早熟禾的致病力测定结果显示,白粉病发病率为49.47%-77.72%,病情指数为 14.41-53.12;仅'太行'草地早熟禾对BGP(TG)表现为中抗,'应县''黑杰克'和'浑源'草地早熟禾表现为中感,'探险家'和'奖品'草地早熟禾表现为极感,其余 17 个品种表现为高感,占比达 73.91%.[结论]山西省草地早熟禾白粉菌分离株BGP(TG)的致病力较强,进一步挖掘'太行'草地早熟禾的抗白粉病基因,对草地早熟禾抗白粉病育种工作具有重要意义.

报道一种在湖南地区发现的黄秋葵花蕾病原真菌.利用PDA培养基分离纯化病原菌株并依据柯赫氏法确定为病害的病原物,通过形态学鉴定和ITS序列分析鉴定病原种类.结果表明,从黄秋葵染病花蕾组织中分离纯化了一种病原真菌,通过形态观察以及ITS序列的比对分析,将该菌株鉴定为棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus);其田间接种黄秋葵花蕾的致病率为80％.这是首次报道棘孢曲霉是黄秋葵花蕾病害的病原菌.

目的:对动物药材DNA提取方法进行优化,利用优化方法提取市售动物药材DNA并进行DNA条形码鉴定.方法:基于SDS法DNA提取原理,比较裂解液中不同EDTA浓度(0.025、0.25、0.5 mol· L-1)、是否含NaC1和Triton X-100等因素对不同用药部位动物药材DNA提取质量的影响,筛选得到最佳裂解液配方;使用优化的裂解液配方提取121份市售动物药材DNA并进行基原物种鉴定.结果:裂解液配方为1％ SDS、0.03 mol· L-1Tris-HCl、0.25 mol·L-1EDTA、0.2 mol·L1NaCl对不同用药部位动物药材DNA提取效果最佳,并可实现对蝉蜕等提取困难样本DNA的提取;利用优化裂解液提取的121份市售动物药材DNA满足中药材分子鉴定后续实验要求,所有市售动物药材均可准确鉴定到基原物种.结论:本研究优化的裂解液配方可用于除壳类、分泌物类、加工品外不同用药部位动物药材的DNA提取,为动物药材分子鉴定提供了技术支持.

目的:应用psbA-trnH序列对芦根及其混伪品进行鉴定研究,为该药材的临床用药安全和市场监管等方面提供参考.方法:对芦根及其基原物种进行DNA提取、PCR扩增psbA-trnH序列、双向测序,结合GenBank下载序列,对序列进行比对、计算遗传距离、构建NJ系统聚类树.结果:芦根psbA-trnH序列长度为482～483 bp,种内有2个变异位点,有2种单倍型,G+C含量为37.7％ ～37.8％.芦根psbA-trnH序列种内遗传距离为0～0.0042,芦根与其混伪品的种间遗传距离为0.0083～0.0361,大于芦根种内最大遗传距离.基于psbA-trnH序列构建的NJ聚类树显示,芦根样品单独聚为一支,其混伪品各自聚为一支.结论:应用psbA-trnH序列可以鉴别芦根及其混伪品.

随着雷公藤药材在临床应用比较广泛,其市场上的伪品较多,传统技术不能有效的鉴别该中药的真伪.该实验拟基于DNA条形码和化学指纹图谱方法对雷公藤属药材进行准确的鉴定及质量评价.采用DNA条形码技术、隐马尔可夫模型的HMMer注释方法和K2P模型进行遗传距离分析,并结合最近距离法、相似性搜索法、构建NJ树等方法对雷公藤的DNA序列进行鉴定和评估;采用UPLC-PDA方法建立雷公藤药材指纹图谱,评价不同来源的药材指纹图谱的相似度;采用LC-MS/MS方法检测雷公藤主要成分的含量.结果表明:药材基原物种雷公藤的ITS2序列种内最大K2P遗传距离均远小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离;应用相似性搜索法分析结果表明ITS2序列初步鉴定雷公藤药材及其混伪品;在NJ聚类树上雷公藤药材及其混伪品聚类较为清晰,初步分析27份样品中有12种为雷公藤正品.化学指纹谱研究表明特征1区可以较为直观的区分雷公藤伪品;LC-MS/MS.HCA-热图分析表明不同产地雷公藤药材6种有效成分的含量差异显著,可评价雷公藤药材的质量.该实验对雷公藤属的药材准确鉴定及质量评价具有指导意义.

海马是我国名贵动物药材之一,市售海马基原众多,鉴别困难.对其商品进行基原调查有助于澄清品种,为市售海马药材的鉴别以及建立质量控制标准提供科学依据.该研究通过随机采集安国、毫州等全国8个主流药材市场的海马商品药材,将CO Ⅰ片段DNA测序和形态鉴别相结合,确定基原物种.结果发现市售海马样品共来源于23个物种,包括所有2015年版《中国药典》收载物种及18个非《中国药典》收载海马属物种.其中地图海马、驼背海马、南非海马、北部湾海马、欧洲海马、半棘海马、条纹海马等均为首次发现于我国中药材市场.DNA序列分析结合形态鉴定,有助于准确鉴定海马基原.

DNA宏条形码(DNA metabarcording)是利用高通量测序技术获得混合条形码扩增序列,通过生物信息学分析手段来鉴定混合样本中物种组成的方法,已广泛用于宏基因组学、动植物生物多样性等研究,并开始应用于传统草药的鉴定领域,为混合草药物种鉴定困难提供了有力的手段.该文主要总结了目前DNA宏条形码在混合中草药基原物种鉴定研究中的应用进展,重点比较分析了Sanger一代、二代以及三代高通量测序技术在混合中草药鉴定中的优劣性,并展望DNA宏条形码在混合中草药产品鉴定中的应用前景.