目的:探讨在直接抗病毒药物（DAAs）经治的慢性丙型肝炎（CHC）患者中，壳多糖酶3样蛋白1（CHI3L1）、高尔基体蛋白73（GP73）诊断肝硬化的效能及丙型肝炎病毒清除后CHI3L1、GP73的动态变化特点。方法:收集从2017年1月至2019年12月确诊的105例丙型肝炎患者的资料，绘制受试者操作特征曲线（ROC）来研究血清CHI3L1、GP73诊断肝硬化的效能，Friedman检验用于比较CHI3L1、GP73的变化特点。正态分布的连续变量比较采用方差分析和 t检验进行统计分析；非正态分布的连续变量比较采用秩和检验进行统计分析；分类变量用Fisher精确检验和 χ2检验进行统计分析；相关分析用Spearman相关分析法。 结果:基线时CHI3L1及GP73诊断肝硬化的ROC下面积为0.939和0.839。DAAs组患者血清CHI3L1及GP73水平在治疗结束时与基线相比显著下降[123.79（60.25，178.80）ng/ml与118.20（47.68，151.36）ng/ml， P = 0.001；105.73 （85.05，130.69）ng/ml与95.52 （69.52，118.97）ng/ml， P = 0.001]；聚乙二醇干扰素联合利巴韦林（PR）组患者血清CHI3L1及GP73在治疗结束第24周时与基线相比显著下降[89.15（39.15, 149.74）ng/ml与69.98 （20.52，71.96）ng/ml， P < 0.05；85.07（60.07，121.00）ng/ml与54.17（29.17，78.65）ng/ml， P < 0.05]。 结论:CHI3L1及GP73是敏感的血清学标志物，可用于监测治疗期间和达到持续病毒学应答后CHC患者的纤维化转归。DAAs组患者血清CHI3L1及GP73水平下降较PR组患者早，未治疗组患者血清CHI3L1水平在随访约2年时较基线升高。

目的:探讨辽宁地区汉族人群中几丁质酶-3样蛋白-1(chitinase 3-like 1, CHI3L1)基因rs4950928以及血小板膜糖蛋白Ⅵ(GPⅥ)基因rs1671153和rs1654419多态性与大动脉粥样硬化性卒中(large artery atherosclerotic stroke, LAA)的相关性。方法:采用病例对照研究方法，病例组选取自2017年1月至2017年6月在中国医科大学附属盛京医院神经内科连续就诊的LAA患者，对照组选取自盛京医院体检中心同期年龄和性别相匹配的健康体检者。采用聚合酶链反应进行目的基因片段扩增，然后采用改良多重连接酶反应技术对rs4950928以及rs1671153和rs1654419进行基因分型。采用多变量 logistic回归模型分析基因多态性与LAA发病的相关性。 结果:共纳入214例LAA患者和198例健康对照者。病例组CHI3L1基因rs4950928以及GPⅥ基因rs1671153和rs1654419基因型和等位基因分布频率与对照组差异均无统计学意义，显性模型和隐性模型分析差异亦无统计学意义。结论:CHI3L1基因rs4950928以及GPⅥ基因rs1671153和rs1654419多态性与辽宁地区汉族人群LAA易感性无显著相关性，各等位基因的存在均无法构成LAA发病的危险因素。

目的:探究微小RNA(miR)-103a-3p/壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)在卵巢癌细胞增殖和血管拟生中的作用机制及对转化生长因子-β(TGF-β)通路的影响。方法:通过生物信息学分析miR-103a-3p的表达水平与卵巢癌患者总生存率间的关系。将人卵巢腺癌细胞株SKOV3细胞分为4组：对照组、miR-103a-3p mimic组、miR-103a-3p mimic＋CHI3L1组和CHI3L1组。采用定量聚合酶链反应(qPCR)和Western blotting分别检测miR-103a-3p、CHI3L1 mRNA和CHI3L1蛋白的表达水平。采用酶联免疫吸附法检测细胞培养液中YKL-40的表达水平。采用CCK-8法、克隆形成实验和血管生成实验检测4组细胞活力、增殖能力和血管生成能力。通过双荧光素酶报告验证miR-130a-3p靶向CHI3L1。结果:miR-103a-3p高表达组卵巢癌患者总体生存率高于miR-103a-3p低表达组( χ2＝6.187， P＝0.048)。对照组、miR-103a-3p mimic组、miR-103a-3p mimic＋CHI3L1组和CHI3L1组4组之间miR-103a-3p和CHI3L1 mRNA的水平差异均具有统计学意义( F＝198.254， P<0.001； F＝60.214， P<0.001)，miR-103a-3p mimic组和miR-103a-3p mimic＋CHI3L1组的miR-103a-3p水平高于对照组(均 P<0.001)，CHI3L1组的CHI3L1 mRNA水平显著高于对照组( P<0.001)。4组CHI3L1蛋白的表达水平分别为2.25±0.23、1.19±0.12、2.29±0.28、4.31±0.37，差异具有统计学意义( F＝18.675， P<0.001)。4组细胞培养液中YKL-40的表达水平分别为(1.84±0.20)ng/ml、(0.95±0.08)ng/ml、(2.64±0.25)ng/ml、(6.27±0.79)ng/ml，差异具有统计学意义( F＝35.297， P<0.001)，CHI3L1组的YKL-40水平显著高于对照组( P<0.001)，miR-103a-3p mimic组的YKL-40水平低于对照组( P<0.001)，miR-103a-3p mimic＋CHI3L1组的YKL-40水平高于miR-103a-3p mimic组( P<0.001)。4组的细胞活力分别为100%±2.54%、76.23%±2.13%、104.89%±3.56%、137.42%±2.80%，差异具有统计学意义( F＝23.584， P<0.001)，miR-103a-3p mimic组的细胞活力显著低于对照组( P<0.001)，CHI3L1组显著高于对照组( P<0.001)，miR-103a-3p mimic＋CHI3L1组显著高于miR-103a-3p mimic组( P<0.001)。4组细胞的克隆形成数分别为(76.85±4.67)个、(21.56±2.85)个、(72.06±5.07)个、(169.63±9.21)个，差异具有统计学意义( F＝31.541， P<0.001)，miR-103a-3p mimic组细胞的增殖能力显著低于对照组( P<0.001)，CHI3L1组显著高于对照组( P<0.001)，miR-103a-3p mimic＋CHI3L1组显著高于miR-103a-3p mimic组( P<0.001)。4组细胞的相对管长度和管分支差异均具有统计学意义( F＝24.254， P<0.001; F＝27.564, P<0.001)。4组细胞的TGF-β和Smad水平比较差异均具有统计学意义( F＝30.254， P<0.001； F＝34.187， P<0.001)。双荧光素酶实验结果显示，与转染NC组相比较，共转染miR-103a-3p与CHI3L1-wt后细胞中荧光素酶活性显著降低。分别使用NC和miR-103a-3p与CHI3L1-mut共转染后细胞中荧光素酶活性变化不大。 结论:miR-103a-3p通过直接靶向抑制CHI3L1的表达，从而抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖和血管生成能力，抑制卵巢癌淋巴转移和远端转移，这可能与TGF-β通路有关。

目的 比较在超声引导下聚桂醇与无水乙醇硬化治疗肝囊肿(HC)患者的疗效.方法 2019年10月～2022年10月我院收治的HC患者107例,被随机分为观察组54例和对照组53例,分别在超声引导下穿刺囊腔内注射聚桂醇或无水乙醇治疗,于治疗后6个月复查超声.采用荧光免疫分析法检测血清高尔基体蛋白73(GP73)、蛋白二硫化物异构酶A3(PDIA3)和壳多糖酶3样蛋白1(CHI3L1)水平,采用ELISA法检测血清髓过氧化物酶(MPO)和皮质醇(Cor)水平,采用化学发光法检测血清淀粉样蛋白A(SAA)水平,采用视觉模拟评分法(VAS)评价疼痛程度.结果 观察组治疗总有效率为98.1％,显著高于对照组的88.7％(P＜0.05),在随访时,观察组囊肿复发率为3.7％,显著低于对照组的16.9％(P＜0.05);在术后 1w,观察组血清 GP73、PDIA3 和 CHI3L1 水平分别为(23.1±3.8)pg/L、(69.2±5.6)ng/mL 和(44.9±4.9)ng/L,显著低于对照组[分别为(37.3±4.3)pg/L、(94.8±5.4)ng/mL 和(67.7±4.6)ng/L,P＜0.05];观察组血清MPO、Cor和SAA水平分别为(121.5±18.3)U/L、(259.7±24.1)ng/L和(14.5±2.5)mg/L,显著低于对照组[分别为(158.1±20.1)U/L、(298.6±26.3)ng/L 和(20.2±3.1)mg/L,P＜0.05];在术后 1 d 和 3 d,观察组 VAS 评分分别为(3.1± 0.6)分和(2.2±0.3)分,均显著低于对照组[分别为(4.5±0.5)分和(3.2±0.4)分,P＜0.05];术后,对照组出现腹痛和醉酒貌等不良反应发生率为20.8％,显著高于观察组的3.7％(P＜0.05).结论 在超声引导下穿刺向囊腔内注射聚桂醇硬化治疗HC患者可能比注射无水乙醇有更好的临床疗效,且不良反应发生率低,可能与激起机体应激反应轻有关.

目的 建立鼻腔喷雾型重组乙型肝炎疫苗中乙肝病毒表面抗原(HBsAg)含量检测方法,并进行验证.方法 通过对壳聚糖酶的处理条件(反应温度、酶浓度和酶解时间)进行优化,建立鼻腔喷雾型重组乙肝疫苗中HBsAg含量检测方法,并对该方法进行特异性、线性范围、准确度、精密度(重复性、中间精密度)及耐用性验证.结果 确定壳聚糖酶处理条件为:2 U/ml的壳聚糖酶于37℃水浴中孵育60 min,然后采用基于化学发光法的试剂盒定量检测HBsAg含量.壳聚糖酶的加入不会对疫苗中HBsAg含量检测产生干扰;HBsAg浓度在1.25～ 160ng/ml之间与发光值具有良好的线性(r2≥0.95);高、中、低浓度疫苗的平均回收率分别为100.18％、103.54％和113.88％;重复性及中间精密度验证结果的变异系数(CV)均≤20％;壳聚糖酶浓度在1.5～2.5 U/ml之间以及酶解时间为60 min,测定值CV均符合≤20％的验证审定标准.结论 建立了鼻腔喷雾型重组乙型肝炎疫苗中HBsAg含量检测方法,该方法具有良好的特异性、准确度、精密度及耐用性,可用于该疫苗的质量控制.

壳聚糖酶是1种催化降解壳聚糖的专一性糖苷水解酶.基于近年来国内外壳聚糖酶的研究成果,本文对壳聚糖酶的来源与性质、发酵生产和分离纯化、重组表达与工程化研究及其应用开发进行了综述,探讨了壳聚糖酶研究中存在的问题及今后的研究方向,为其进一步开发利用提供参考.

对来源于枯草芽孢杆菌菌株168(Bacillus subtilis 168)的壳聚糖酶编码基因进行了序列优化及全合成,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中实现了分泌表达,表达产物的蛋白质浓度达到0.30mg/ml.表达的壳聚糖酶最适pH为5.6,最适温度为55℃,比酶活达84.54U/ml.该酶在50℃及以下较稳定.利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)对产物的组分进行了分离及鉴定.根据一级质谱信息,推测酶解产物中包含至少37种聚合度2 ～18,不同脱乙酰度的壳寡糖组分.综上,利用毕赤酵母分泌表达了来源于枯草芽孢杆菌菌株168的壳聚糖酶基因,利用表达产物水解制备了低脱乙酰度壳寡糖并对其组分进行了分析,可为后续壳寡糖结构与功能关系的研究提供参考.

目的 通过研究壳聚糖酶的急性经口毒性试验、遗传毒性试验和亚慢性毒性试验,对其安全性进行研究和评价,为其合理开发及利用提供科学依据.方法 根据GB15193-2003食品安全性毒理学评价程序和方法,采用急性经口毒性试验、3项遗传毒性试验(Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验及小鼠精子畸形试验)、90d喂养试验对壳聚糖酶的毒理学安全性进行研究和评价.结果 壳聚糖酶对昆明种小鼠的最大耐受剂量大于20.0 g/kg· bw;3项遗传毒性试验结果均为阴性;以0.2 g/kg·bw、0.4g/kg· bw和0.6g/kg· bw剂量的壳聚糖酶给予SD种大鼠连续灌胃90 d,将各剂量组的体重、增重、食物利用率、血液学指标、脏器重量及脏器/体重比值与对照组进行统计学分析,结果其差异无统计学意义(P＞0.05),大体解剖和组织病理学检查未见与样品有关的异常改变.结论 根据GB15193-2003食品安全性毒理学评价程序和方法的要求和标准,在本实验室条件下,壳聚糖酶的最大耐受剂量大于20.0 g/kg·bw,属无毒物,无遗传毒性,其90d喂养试验的未观察到有害作用剂量(NOAEL)为0.6 mg/kg·bw.

几丁质每年自然总产量高达100亿吨,目前由于工业上缺乏清洁高效的几丁质降解工艺,几丁质资源的利用受到严重制约.以壳聚糖为唯一碳源从土壤中分离筛选出一株具有产壳聚糖酶能力的菌株MY001,发酵上清酶活力约为2.7 U/mg,利用16S rDNA、gyrA及gyrB基因测序的方法将该菌株鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens).通过分析MY001菌株在不同培养基中的生长曲线特点,结合MY001菌株降解后的几丁质的扫描电镜观察结果,发现该菌株可以直接利用几丁质.另外,发现该菌株对芦笋茎枯病菌[Phomopsis asparagi (Sacc.) Bubak]具有拮抗作用.当胶体几丁质和MY001菌株同时存在时,对芦笋茎枯病菌的抑制更加明显.上述结果表明,解淀粉芽孢杆菌MY001菌株具有降解几丁质和拮抗芦笋茎枯病菌的功能,而且添加几丁质具有拮抗增效作用,因此该菌株有望用于几丁质资源清洁利用和农作物真菌病害生物防治.

壳寡糖具有抗炎、抗肿瘤及激活植物免疫等一系列生物活性,这些生物活性的发挥与其结构直接相关.为最大程度发挥壳寡糖的生物活性并确定其结构与功能关系,有必要制备不同结构特征的壳寡糖.笔者优化并全基因合成环状芽胞杆菌壳聚糖酶基因,利用毕赤酵母进行分泌表达;用该酶水解制备低脱乙酰度壳寡糖,使用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱对其组分进行分离及鉴定,使用核磁共振确定其末端结构特征.结果表明:所得壳聚糖酶蛋白质量浓度达0.77 mg/mL,水解产物中包含至少37种不同的壳寡糖组分,这些组分的还原末端主要由氨基葡萄糖组成,非还原末端同时包含氨基葡萄糖及N乙酰氨基葡萄糖.本研究为壳寡糖结构与功能关系的阐释奠定基础.