MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)家族转录因子是高等植物转录因子中数目最多的一类基因家族成员,可分为 4 个亚家族,其中R2R3-MYB是最常见的亚家族类型.R2R3-MYB类转录因子广泛参与植物的器官发育和次生代谢产物生物合成的调控.为研究R2R3-MYB家族转录因子在艾叶黄酮合成和腺毛发育中发挥的作用,该研究基于艾的全基因组数据筛选、鉴定出 92 个R2R3-MYB转录因子,并利用生物信息学预测其潜在功能.结果表明,92 个转录因子的氨基酸长度为 168～547 aa,相对分子质量为 19.6～60.5 kDa,均为亲水性蛋白.亚细胞定位分析表明,89 个AaMYB 蛋白定位结果为细胞核,3 个蛋白同时定位于细胞核和细胞质中.依据拟南芥R2R3-MYB家族分类,92 个艾R2R3-MYB蛋白分为 26 个亚家族,同一亚族基因结构基本类似.顺式作用元件预测结果表明光响应元件、茉莉酸甲酯元件和脱落酸元件在R2R3-MYB基因启动子区域分布广泛.转录组表达分析结果显示,AaMYB60、AaMYB63 和AaMYB86 在叶片中的表达均高于茎和根中的表达,说明这 3 个转录因子主要在叶片中发挥作用.此外,利用系统进化分析筛选出 5 个参与艾叶黄酮生物合成或腺毛发育的候选R2R3-MYB转录因子.该研究可为后期艾的优良品种选育和种质创新等提供重要的基因资源.

[目的]探讨不同浓度外源茉莉酸甲酯(MeJA)诱导大麦抗叶斑病效应差异及其分子机制,为应用MeJA防治大麦叶斑病提供理论依据.[方法]以'蒙啤麦3号'大麦品种幼苗为材料,设置不接菌(无菌水处理叶片)、接菌(无菌水处理叶片接种麦根腐平脐蠕孢菌)和接菌+MeJA(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mmol/L MeJA喷施叶片后接菌)3组处理,于三叶期调查叶斑病发病情况,并据此筛选最适MeJA浓度,然后测定不接菌、接菌及接菌+MeJA(最适浓度)下不同处理时间叶片的抗氧化酶、抗病相关酶活性、丙二醛含量、渗透调节物质含量以及相关基因表达水平.[结果](1)叶面喷施外源MeJA提高了大麦对叶斑病的抗性,1.5 mmol/L MeJA处理叶片的病情指数较对照显著降低19.03％,诱导抗性效果最佳;(2)与单独接菌处理相比,1.5 mmol/L MeJA处理大麦叶片超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性均显著提高,而其丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量显著降低,同时受MeJA调控转录因子及编码抗病相关酶的基因表达量显著上调.[结论]外源喷施1.5 mmol/L MeJA通过调节抗病相关酶活性和渗透调节物质含量,以及调控抗病相关酶基因及茉莉酸信号途径关键转录因子基因表达,进而提高大麦植株的叶斑病抗性.

目的 克隆三叶崖爬藤Tetrastigma hemsleyanum查耳酮异构酶(chalcone isomerase,CHI)基因,探究 CHI基因对三叶崖爬藤黄酮合成途径的调控作用.方法 分析三叶崖爬藤转录组,获得三叶崖爬藤CHI基因序列,并进行生物信息学分析.采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定三叶崖爬藤根、茎、块茎、老叶、幼叶及吲哚-3-乙酸(3-indoleacetic acid,IAA)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、脱落酸(abscisic acid,ABA)、水杨酸(salicylic acid,SA)和酵母提取物(yeast extract,YE)等诱导条件下CHI基因的表达量,利用分光光度法测定黄酮含量和CHI酶活性变化,并对其进行相关性分析.结果 转录组数据分析结果表明,三叶崖爬藤CHI基因全长为1096bp(GenBank序号:OQ588006),含有1个长为714bp的开放阅读框,编码237个氨基酸.三叶崖爬藤CHI蛋白分子式为C1148Hi819N285O348S5,等电点(PI)为5.28,相对分子质量为25 340,编码的氨基酸全都在膜外,不具跨膜结构,也不存在信号肽.三维空间结构分析表明,三叶崖爬藤CHI蛋白呈明显的倒置三明治状折叠结构,属于Chalcone-3超基因家族.进化树分析结果表明,三叶崖爬藤CHI蛋白序列与葡萄科植物亲缘关系最近.qRT-PCR结果表明,三叶崖爬藤CHI基因在三叶崖爬藤根、茎、块茎、老叶和幼叶等不同组织中均表达.诱导分析结果表明,5种外源诱导物质均提高了三叶崖爬藤黄酮含量,ABA诱导后CHI基因表达水平在72h达到最高,其余诱导处理CHI基因表达量均在96h达到最高,CHI酶活性均在96h达到最高.相关性分析结果表明,三叶崖爬藤黄酮含量与CHI基因表达量不存在显著相关性,与CHI酶活性存在极显著正相关(R2=0.453).结论 成功克隆了三叶崖爬藤CHI基因,该基因在三叶崖爬藤各组织中均表达.IAA、MeJA、ABA、SA和YE均促进CHI基因表达及酶活性的上升,在转录和翻译水平上调控三叶崖爬藤黄酮合成.

薄荷是我国传统中草药,具有极大的药用和经济价值.脱落酸(ABA)受体PYLs在植物生长发育及逆境响应方面具有重要作用.克隆薄荷McPYL4 基因,对其蛋白特征、基因表达和蛋白互作进行分析,将为薄荷抗逆遗传改良和分子设计育种提供基因资源.故而通过生物信息学分析、烟草叶片瞬时表达、RT-qPCR、Y2H技术对McPYL4 的蛋白特性、亚细胞定位、基因表达模式和蛋白互作进行分析.结果显示,McPYL4 基因全长 621 bp,编码 206 个氨基酸,其蛋白具有SRPBCC保守结构域,与丹参SmPYL4 最同源;McPYL4 蛋白定位于细胞膜和细胞核;McPYL4 基因在薄荷的各个组织中均有表达,根中表达最高,叶片次之,叶 1 至叶 8 呈现先上后下的表达模式;在叶片和根中,McPYL4 基因均响应外源激素ABA、茉莉酸甲酯(MeJA)以及干旱、AlCl3、NaCl、CdCl2 和CuCl2 处理,并且,McPYL4 在MeJA处理下的叶片和根中,以及AlCl3 胁迫处理 1 h的叶片中上调表达,而其他处理下McPYL4 在叶片和根中均呈现下调的趋势;蛋白互作结果显示,McPYL4 以ABA不依赖的形式与AtABIs蛋白相互作用.该研究表明McPYL4 响应ABA、茉莉酸(JA)以及多个非生物胁迫处理,并且McPYL4 参与薄荷中ABA信号转导,从而参与薄荷的叶片发育及各种非生物胁迫的调控.

目的:研究外源茉莉酸甲酯(methyl Jasmonate,MeJA)对牛大力有效成分含量的影响,探究其对异黄酮生物合成以及茉莉酸(jasmonate,JA)信号通路关键酶基因的调控模式.方法:以牛大力幼苗为材料,采用HPLC法分析MeJA对有效成分含量的影响,利用Illumina HiSeq平台进行转录组测序,并利用qRT-PCR技术验证相关基因的表达量.结果:外源MeJA诱导提高了牛大力有效成分芒柄花素与高丽槐素的含量.基于牛大力参考基因组数据库,鉴定出20 727 个差异基因(DEGs),其中9 091 个为上调基因,主要富集在植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、异黄酮生物合成等代谢通路,qRT-PCR结果验证了转录组测序结果准确可靠.外源MeJA激活了部分异黄酮生物合成和JA信号通路关键酶基因的表达,其中异黄酮生物合成途径基因 CHS、HIDs、I3'Hs、VR、PTR、CYP81E7、7IOMT、PTS等呈上调表达;JA信号通路基因LOXs、AOSs、OPR、ACXs、JAZs和MYCs等呈上调表达.结论:牛大力在响应外源MeJA诱导的过程中可激活CHS、HID-1、VR等异黄酮生物合成途径和LOX、MYC等JA信号通路关键酶基因,从而正向调控其有效成分芒柄花素与高丽槐素含量.

天然除虫菊酯是从除虫菊(Tanacetum cinerariifolium)中提取的绿色植物源生物杀虫剂.醛脱氢酶(TcALDH)和GDSL脂肪酶(TcGLIP)是除虫菊酯生物合成途径中的关键限速酶.为探究TcALDH和TcGLIP基因的功能,该研究从除虫菊无性系'W99'中克隆得到TcALDH和TcGLIP基因的启动子,并通过生物信息学分析、组织化学染色(GUS染色)、荧光素酶报告实验和外源植物激素处理实验对其启动子的调控元件、启动子活性、激素诱导特异性和组织特异性进行分析.结果表明:(1)克隆得到的TcALDH和TcGLIP启动子序列分别为2 848、1 343 bp,均含有多个与逆境应答和激素信号相关的顺式作用元件.(2)分别构建了启动子和荧光素酶融合的植物表达载体,在烟草叶片中观察荧光成像发现,TcALDH 启动子具有茉莉酸甲酯(MeJA)和脱落酸(ABA)激素诱导特异性.(3)用MeJA和ABA处理除虫菊'W99'组培苗发现,TcALDH的表达量在 12h内受ABA诱导时上调,受MeJA诱导时先升高后降低,TcGLIP的表达量受ABA和MeJA诱导下调.(4)分别构建了TcALDH和TcGLIP启动子与GUS基因融合的植物表达载体,转化烟草并对其转基因叶片进行GUS活性染色发现,TcALDH启动子在烟草叶片腺体、腺毛头部及叶肉细胞中表达,而TcGLIP启动子仅在烟草叶肉细胞中表达.综上认为,TcALDH和TcGLIP的启动子具有组织特异性,TcALDH启动子具有MeJA和ABA激素诱导特性.该研究结果为除虫菊TcALDH和TcGLIP基因参与除虫菊酯合成的调控机制提供了新见解.

穿心莲内酯为传统中药穿心莲中的主要有效成分,具有多种药理活性,广泛运用于临床,但其生物合成途径尚未被解析.细胞色素P450还原酶为CYP450提供电子,在CYP450的催化过程中起重要作用.该研究通过同源比对筛选并克隆了 穿心莲CPR的编码序列,命名为ApCPR4.原核表达ApCPR4蛋白,分离纯化后进行体外酶活鉴定,发现ApCPR4能够以NADPH依赖性方式还原细胞色素c和铁氰化物.为了验证其体内功能,将ApCPR4与CYP76AH1共转化入酵母工程菌,结果表明,ApCPR4在酵母体内能够协助CYP76AH1催化生成铁锈醇.实时定量PCR结果显示,在茉莉酸甲酯(MeJA)处理的叶片中,ApCPR4的表达量逐渐增加.该表达模式与穿心莲内酯受MeJA诱导积累的趋势一致,推测ApCPR4与穿心莲内酯的生物合成相关.

目的:单加氧酶(Monooxygenase,MO)是一类通过在底物上加一个氧原子的加氧酶,在动植物体内参与多种代谢途径.本实验致力于从雷公藤转录组数据中克隆得到单加氧酶基因cDNA全长,并对克隆得到的MO基因进行初步的功能分析.方法:通过对雷公藤转录组数据中筛选得到MO基因片段设计特异性引物,克隆MO基因cDNA全长,通过生物信息学方法对得到的MO基因进行分析,主要包括多重序列比对,蛋白结构预测和构建进化树分析等.结果:根据分析结果TwMO基因全长为2193 bp,共编码507个氨基酸,等电点为8.84,相对分子质量为55.20 kDa,多重序列比对显示它与其他植物的MO基因具有较高的同源性.雷公藤悬浮细胞经外源茉莉酸甲酯(MeJA)诱导后,实时荧光定量结果显示,Tw-MO的表达量明显增加,并在48 h达到最高,提示TwMO基因与雷公藤的次生代谢产物的生成有关.结论:本研究首次从雷公藤悬浮细胞中克隆得到MO基因,为进一步研究该基因的功能奠定基础.

CIPK是植物钙感受器钙调磷酸酶B类似蛋白特定靶向的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.根据拟南芥AtCIPK8基因序列,利用同源克隆的方法从抗逆性较强的小麦品种石4185中克隆了一个编码序列全长为1350 bp的蛋白激酶基因TaCIPK8(GenBank号:KJ561804.1).序列分析表明该基因编码的蛋白含有449个氨基酸,分子量为52.24 kD,理论等电点为7.16,具有CIPKs家族蛋白所特有的N端激酶域和C端NAF/FISL结构域;与拟南芥AtCIPK8蛋白序列相似度达83.5％.为进一步研究其功能,采用Real-time PCR方法检测该基因在胁迫条件下的响应情况,发现TaCIPK8基因受高盐、外源ABA和低温(4℃)胁迫诱导表达.利用植物启动子数据库PlantCARE和PLACE对TaCIPK8基因启动子序列进行分析,结果显示TaCIPK基因启动子存在大量应答脱水胁迫、干旱、低温和ABA的顺式作用元件,也存在一些响应激素GA和茉莉酸甲酯的元件.利用酵母双杂交方法研究TaCIPK8和TaCBL家族蛋白的互作,结果显示,共转化含有TaCIPK8和TaCBL3基因载体的酵母菌能够在SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/AbA三种培养基上生长,且在后两种培养基上长出蓝色菌落.结果说明TaCIPK8与TaCBL3发生了互作,进而引起了报告基因MEL1、AUR1-C、HIS3和ADE2的表达.该研究结果对于研究TaCIPK8基因的功能以及与CBL蛋白的互作调控网络具有一定的参考作用.

本研究对菘蓝CY P83A 1基因进行了克隆、表达特性及原核表达研究.结果表明,IiCYP 83A 1基因组DNA全长为1 622 bp,包含2个外显子和1个内含子;cDNA全长为1 512 bp,编码503个氨基酸.IiCY P83A 1编码的蛋白包含2个跨膜结构域,无信号肽,主要定位于内质网膜,属于亲水性蛋白,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,与萝卜、欧洲油菜、西兰花和芜菁等植物的CYP83A1蛋白具有较高的同源性.qRT-PCR结果表明,IiCY P83A 1在不同组织中的表达具有显著性差异,表现为茎＞叶＞果＞花和根;在幼苗期、生长期和花期的表达量显著高于萌芽期;茉莉酸甲酯(MeJA)和伤害处理能够显著促进该基因的表达,而低温(4℃)和水杨酸(SA)处理则对其表达具有一定的抑制作用.将克隆到的IiCY P83A 1基因连接到表达载体pET-28a上,构建原核表达载体pET-28a-IiCY P83A 1并对其进行原核表达.SDS-PAGE结果显示,在E.coli BL21中成功诱导表达了CYP83A1蛋白,与预期蛋白分子量大小一致.本研究结果可为进一步研究IiCY P83A 1的功能提供实验依据.