[目的]探究产胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)菌株在促进盐碱土中植物生长,改善土壤性能等方面的影响,为研制适用于盐碱土壤修复的微生物菌剂奠定基础.[方法]从新疆喀什地区盐碱草地根际土壤中筛选产胞外多糖菌株,基于 16S rRNA基因序列比对及系统发育分析对产胞外多糖菌株进行种属鉴定,采用单因素和响应面法优化最高产菌株的培养基组分,通过接种试验评估其对盐碱土栽培植物的促生效果及土壤团聚体的影响.[结果]共筛选出 19 株具有产胞外多糖能力的菌株,隶属于7 个菌属,以假单胞菌属(Pseudomonas)占绝对优势.菌株产糖量介于 236-1 544 mg/L,尤以泛菌属Pantoea MQ A0 产糖量最高,且兼具固氮、产吲哚乙酸(IAA)和铁载体、解磷等功能.MQ A0 的最适产糖发酵培养基为甘油 12.5 mL/L,蛋白胨 9.0 g/L,酵母粉 5.5 g/L,CaCO3 5.1 g/L,在此条件下菌株产糖量达 2 436 mg/L,较优化前增加 57.8%.接种MQ A0 发酵液使盐碱土栽培的玉米株高、鲜重、茎粗、须根数和总根长分别提高 41.2%、203.0%、42.7%、30.4%和 99.7%;粗多糖提取液对土壤团聚体的形成也有显著促进作用(P<0.05).[结论]高产胞外多糖菌株MQ A0 兼具多种促生特性,在促进盐碱土中植物生长和土壤改良方面效果显著.

[目的]黄淮海平原小麦玉米生产区主要实行冬小麦-夏玉米轮作种植模式.砂质潮土是广泛分布于黄淮海地区的土壤,属性和衍生障碍较多,包括结构性较差、蓄水保肥能力较弱等.为了提高肥料利用率、改善土壤肥力,综合实现作物产量提升和品质优化,筛选了一株多功能促生菌,并在该轮作体系验证其广谱促生效应.[方法]从玉米根际砂质潮土中筛选多功能促生菌,测定其产吲哚乙酸(IAA)、溶有机磷、解钾能力.通过形态学、生理生化及 16S rDNA序列分析方法对其种属进行鉴定.摇瓶条件下探究其产IAA的最适条件,通过玉米盆栽验证其促生能力,通过冬小麦-夏玉米大田试验验证其在轮作体系中的广谱性增产效果.[结果](1)试验筛选得到一株命名为YM3 的多功能根际促生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),其产IAA能力达到59.21 mg/L、解有机磷能力达到 0.72 mg/L、解钾能力达到 18.56 mg/L.当装液量为 25 mL/250 mL,pH 6-8 范围内,分别以麦芽糖、蛋白胨为碳、氮源时,YM3 产IAA能力最佳.(2)玉米盆栽试验结果可见,与接种灭活菌相比,接种YM3 菌水剂的土壤IAA、速效磷、速效钾含量分别显著提高 75.00%、48.66%、20.00%.玉米幼苗的根长、根表面积、根体积、根尖数、根分枝数分别显著增加 67.95%、59.21%、51.13%、71.34%、92.06%.玉米植株的鲜重、株高、相对叶绿素含量、全氮、全磷、全钾分别显著提高了39.86%、23.51%、18.27%、17.68%、52.26%和 36.53%.(3)小麦玉米轮作大田试验结果表明,接种YM3 菌剂的小麦大田土壤有效氮、速效磷、速效钾分别显著增加了 9.08%、13.78%、16.66%,增产率达到 42.18%.玉米大田土壤速效磷和速效钾含量分别显著增加了 19.18%和 15.95%,增产率达到 13.22%.[结论]筛选得到的枯草芽孢杆菌YM3 菌株兼具产IAA、溶有机磷、解钾功能,在黄淮海平原小麦玉米轮作体系土壤中适应性强,广谱性强,能够提升砂质潮土土壤肥力,提高冬小麦-夏玉米轮作体系的产量.

为获得高效拮抗花生病害的生防微生物,以花生冠腐病菌为指示菌,采用稀释涂布平板法和平板对峙法,从山东莱西采集的花生连作田的病、健株根际土壤样品中筛选到 1 株高效生防菌株,编号为ZHX-7.结合形态学特征和 16S rDNA、gyrB序列分析,确定ZHX-7 为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis).ZHX-7 的菌悬液、无菌发酵液和挥发性气体对花生白绢病菌、基腐病菌、网斑病菌和轮斑病菌菌丝生长的抑制均达到极显著的水平,平板对峙试验表明ZHX-7 的菌悬液对花生白绢病菌、基腐病菌、网斑病菌和轮斑病菌的抑菌率分别为 64.40%、70.37%、77.43%和 65.32%.在以ZHX-7 无菌发酵液稀释 10 倍的PDA培养基上,花生白绢病菌、基腐病菌、网斑病菌和轮斑病菌菌丝的生长抑制率分别为 67.81%、52.16%、23.52%和 69.93%.双皿对扣试验表明ZHX-7 的挥发性气体对花生白绢病菌、基腐病菌、网斑病菌和轮斑病菌的抑菌率分别为 86.82%、35.40%、81.70%和 44.19%.ZHX-7 可产生蛋白酶、纤维素酶和淀粉酶等次级代谢产物;此外,在温室盆栽条件下,ZHX-7 有菌发酵液明显促进了花生的生长,同对照相比,鲜质量、干质量分别增加 31.24%和 26.47%,并且ZHX-7 有菌发酵液明显提高了花生对白绢病的抗性,防效达到51.76%.综上所述,本研究筛选获得的一株贝莱斯芽孢杆菌ZHX-7,能够抑制多种花生病原真菌,同时促进花生生长,是一株具有宽广拮抗谱的多功能菌株,具有较好的生防应用潜力.

[背景]砂姜黑土地区存在秸秆腐解缓慢、秸秆还田后作物幼苗生长不良等问题.[目的]从砂姜黑土区农田筛选一株兼具秸秆腐解能力的玉米促生菌 MC29,以促进秸秆腐解和玉米作物生长.[方法]通过 16S rRNA基因序列分析对该菌株进行鉴定;采用液态摇瓶及盆栽试验验证菌株实际促腐、促生能力及土壤养分的提升效果,并且探究菌株的最佳生长及产吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)条件;采用电击转化法将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因导入菌株细胞,并通过 PCR 琼脂糖凝胶电泳进行验证.[结果]分离筛选的玉米促生菌鉴定为纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans).该菌株 MC29 羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose,CMC)酶活可达 13.32 U/mL,产IAA量为 8.63 mg/L.与对照相比,施用菌株MC29 后秸秆腐解率显著提高 24.8%;玉米soil and plant analyzer development(SPAD)值、植株总重、根表面积和根长分别提高 7.6%、21.3%、30.9%和 18.3%;土壤碱解氮含量显著提高 68.1%,土壤速效磷及土壤速效钾含量分别提高5.8%及6.0%.菌株MC29最佳生长条件为pH 7.0、装液量为25/250 mL、碳源为麦芽糖、氮源为酵母粉;最佳产IAA条件为pH 7.0、装液量为 50/250 mL、碳源为果糖、氮源为硝酸钾;成功构建荧光标记菌株MC29-GFP,并据此追踪到其接入砂姜黑土 15 d后定殖量为 2.8×105-9.5×105 copies/g.[结论]所筛选的纤维化纤维微细菌MC29 对于指导砂姜黑土区多功能秸秆促腐菌剂、微生物菌肥的研制及提升作物产量有一定的积极意义,并为探究其在砂姜黑土中的实际应用奠定基础.

从菌糠鸡粪堆肥中筛选高效的解磷菌并优化其解磷能力,发掘多功能微生物资源以实现农业废弃物的有效利用.利用无机磷选择培养基从堆肥中筛选高效解磷菌,结合形态学观察、生理生化试验、分子生物学鉴定,对菌株进行鉴定.利用单因素和响应面试验优化菌株的解磷培养条件;通过解磷、解钾和产吲哚乙酸能力的测定确定菌株的堆肥潜力.筛选得到一株高效解磷菌株Pb1,经鉴定发现菌株隶属于Bacillus smithii strain;培养条件为葡萄糖 15.0 g/L、硫酸铵 3 g/L、磷酸三钙 7.0 g/L、无机盐 0.48 g/L、温度 55.0℃、摇床转速 225 r/min、初始pH 7.0、装液量 60.0 mL/250 mL、接种量 3.0%(V/V)时,菌株Bacillus smithii Pb1 的解磷能力最强;进一步通过响应面优化发现,当磷酸三钙 6.4 g/L、摇床转速 207 r/min、装液量 65.0 mL/250 mL时,菌株Pb1 培养3 d,发酵液中溶磷量可达 534.68 mg/L,是优化前的 1.58 倍.同时,发现B.smithii Pb1 解有机磷、解钾、产吲哚乙酸能力,分别为 238.99 mg/L、81.06 mg/L、23.26 mg/L.菌株B.smithii Pb1 在高温(55℃)条件下展现出了解无机磷、有机磷、解钾和产吲哚乙酸的能力,为菌株B.smithii Pb1 开发成好氧堆肥菌剂奠定基础.

目的:对人源类溶菌酶蛋白4(LYZL4)在受精过程中的作用和重组蛋白的酶学性质进行研究,从而揭示LYZL4的生理功能. 方法:细胞免疫荧光法检测LYZL4在精子细胞上的亚细胞定位,RT-PCR分析精子表面LYZL4的来源,通过精子穿透试验分析LYZL4在受精过程中的作用.构建真核重组表达载体pPIC9K-LYZL4,转化毕赤酵母GS115菌株后,甲醇诱导表达;甲壳素亲和层析和凝胶过滤层析从发酵上清中纯化重组LYZL4蛋白(rLYZL4),通过Western印迹进行验证.ELISA测定rLYZL4的透明质酸结合能力,分光光度法测定rLYZL4的胞壁质酶活性、透明质酸酶活性和自由基清除能力. 结果:LYZL4免疫荧光定位于成熟精子头部的顶体膜上,RT-PCR检测表明精子表面的LYZL4蛋白来源于睾丸和附睾的分泌,兔抗LYZL4多克隆抗体可明显抑制精卵结合.毕赤酵母表达系统成功表达了rLYZL4,酶活性分析显示rLYZL4无胞壁质酶和透明质酸酶活性,但能够结合透明质酸,并具有较强的自由基清除能力. 结论:LYZL4由睾丸和附睾分泌后定位于成熟精子头部的顶体膜上,可在精卵结合过程中发挥作用,其还能够结合透明质酸并清除自由基,提示LYZL4可能作为一种多功能分子在精子保护及精卵结合过程中发挥作用.

为从尼瓦拉野生稻(Oryza nivara)中收集农业微生物肥料生产的菌种资源,对其内生菌进行分离、固氮酶活性测定、IS-PCR指纹图谱聚类、产生长素、解钾能力及生理生化特性测定.选取IS-PCR指纹图谱8个类群的代表菌株进行16S rRNA基因系统发育分析.从尼瓦拉野生稻中共分离到57株内生细菌,其中44株为内生固氮菌,固氮酶活性在5.79-899.72 nmol mL-1 h-1之间.16S rRNA基因序列分析及生理生化特性表明,所分离的植物内生菌属于Burkholderia contaminans、Herbaspirillum seropedicae、Rhizobium sp.、Bacillus methylotrophicus、Achromobacter xyosoxidan、Chryseobacterium bernardeti,Pseudomonas beteli和Klebsiella quasipneumoniae,表明尼瓦拉野生稻内生菌具有多样性.分离到的内生细菌均有产生长素的能力,其中N8、N35、N36产生长素能力最强,分别为41.66、34.96、30.41 mg/L.25株菌株具有不同程度的解钾能力,N37、N16解钾能力最强,分别为312、289 mg/L.N8、N35、N36、N37、N16接种生菜后,生菜株高增加12.47％-26.17％、叶片数增加20.41％-44.90％、叶长增长49.73％-62.23％、地上鲜重增加37.93％-68.00％、地下鲜重增加31.08％-40.56％、叶绿素含量增加27.94％-85.29％.接种菌株N37、N16的土壤与对照组相比,土壤速效钾含量分别增加52.55％和57.85％,表明菌株具有明显的促生效果.综上所述,从尼瓦拉野生稻中筛选到的5株多功能促生菌在未来农业微生物肥料生产应用上具有潜在的价值.

白血病抑制因子(LIF)是一种在生物体内具有独特活性和重要调节作用因而广泛应用的多功能细胞因子.利用基因工程技术表达重组人白血病抑制因子(Recombinant human leukemia inhibitory factor,rhLIF)并进行包涵体的复性及纯化,将rhLI基因克隆到原核表达载体pET32a中,成功构建重组hLI基因工程菌,并研究该菌株发酵条件和纯化工艺.先将种子液进行发酵培养,诱导表达,收集诱导后的细胞;对细胞破碎,收集包涵体沉淀,洗涤包涵体;用6 mol/L盐酸胍变性重溶包涵体,镍离子亲和层析柱上直接复性及纯化,并用阴离子交换进一步纯化,复性率为75％,纯度达97％.结果显示基因序列与理论序列一致,SDS-PAGE分析结果表明其表达的外源蛋白质分子量与预期的目的蛋白质相对分子量大小相一致,均为35×103;Western blotting、MTT活性检测结果表明,此重组hLIF融合蛋白具有良好的抗原性和免疫原性.本研究成功建立了rhLIF原核表达、复性和纯化体系,可为进一步研究LIF生物学活性及产品开发提供试验基础.

[目的]从黄河三角洲滨海湿地土壤中获得同时具备产氢、产电以及异化铁还原能力的多功能菌株.[方法]通过厌氧分离技术从黄河三角洲土壤中分离得到纯菌株,16S rRNA基因测序后与数据库已有序列进行比对.利用革兰氏染色及扫描电镜观察菌株形态,并用气相色谱(gas chromatography,GC)和液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)检测其生理代谢底物和产物.通过添加不同形态铁氧化物检测该菌株Fe(Ⅲ)的还原能力.构建微生物燃料电池(Microbial fuel cells,MFCs)检测该菌株的电化学活性.[结果]16S rRNA基因序列比对发现其与双酶梭菌Clostridium bifermentans的相似性达97.99％.革兰氏染色结果显示为阳性菌.能够利用葡萄糖为底物发酵产生氢气、二氧化碳、乙酸和丁酸.Fe(Ⅲ)还原能力检测发现,其不仅可以还原柠檬酸铁(FeC6H5O7)中可溶性的Fe(Ⅲ),还可以还原无定形铁水铁矿(FeOOH)和晶型纳米磁铁矿(Fe3O4)中的Fe(Ⅲ).此外,经MFCs检测发现,该菌具有电化学活性,最大电流输出密度可达6.5 mA/m2,且在0.15 Ⅴ位置存在氧化峰.[结论]本研究从土壤中成功分离得到了一株同时具有产氢、产电以及异化铁还原能力的多功能梭菌菌株,保藏并命名为Clostridium bifermentans EZ-1.

[目的]从西沙喜盐草根际沉积物中分离纯化得到具有高效固氮能力及解磷能力的菌株.优化其发酵培养条件,研究其制备海洋微生物菌剂的可能性.[方法]从形态学特征、生理生化、16S rDNA及功能基因水平进行鉴定,通过乙炔还原法、钼锑抗显色法检测菌株的固氮酶活性和解磷能力,单因素法和响应面法优化其发酵培养条件,溶血试验和急性毒性实验鉴定菌株的安全性.[结果]结果表明,菌株AZ16属于星箭头菌(Sagittula stellate),革兰氏阴性菌,选择性固氮培养基中菌落呈黄圆形黏稠状,固氮酶活性达34.63 nmol C2H2/(mL·h),最适生长条件为:盐度25‰、pH 7.5、温度33℃、接种量5.0％;菌株XT37为海洋芽孢杆菌(Bacillus sp.),革兰氏阳性菌,选择性固氮培养基中菌落呈深黄色圆形褶皱,植酸酶活性达239.49 μg/L,最适合生长条件为:盐度25‰、pH 6.7、温度28℃、接种量5.0％.溶血实验和急性毒性实验证明两株菌属实际无毒级别.[结论]两株菌具有高效的固氮解磷功能,以及抗高盐、强碱等环境的能力,安全无毒,因此有潜力应用于多功能混合微生物菌剂的研制.