目的:建立一种可单管同时检测新型冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和人源基因内标的一步法多重巢式荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法。方法:收集2020年2月至2022年2月广州白云机场海关入境人员新型冠状病毒核酸阳性样本30份和336份排查样本，以及2020年发生新型冠状病毒肺炎疫情前3年期间同样来自广州白云机场海关入境人员的其他呼吸道病原体阳性样本64份和呼吸疾病国家重点实验室提供的呼吸道病原体阳性毒株7份。选取新型冠状病毒 ORF和N基因，以及甲、乙型流感病毒M基因的核苷酸保守区域，设计和筛选出多重巢式荧光PCR引物和探针组合，同时引入人源基因内标的巢式扩增引物和探针，建立一套多重巢式荧光RT-PCR检测方法，应用制备的假病毒阳性质控品和样本盘，评估方法的敏感度、特异度，并进行临床样本应用性验证。结果:所建立的一步法多重巢式荧光RT-PCR方法可特异性检出新型冠状病毒和甲、乙型流感病毒，新型冠状病毒的最低检出限约为125拷贝/ml，甲、乙型流感病毒的最低检出限约为250拷贝/ml；检测101份各类呼吸道病原体阳性样本，显示新型冠状病毒和甲、乙型流感病毒的检测敏感度分别为96.67%、92.86%和96.15%，三者的特异度均为100%，超过300份临床样本的应用性检测中，未见假阳性检出。结论:建立了一套新型冠状病毒、甲、乙型流感病毒和人源基因内标的一步法多重巢式荧光RT-PCR方法，该方法具有良好的灵敏度和特异性，可用于新型冠状病毒和甲、乙型流感病毒的大批量样本快速筛查。

探讨山东省青岛市地区急性呼吸道感染患儿人副流感病毒3型（HPIV-3）的感染情况，并分析HPIV-3血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）基因特征。本研究为横断面研究，青岛市妇女儿童医院、青岛大学附属医院西海岸院区及崂山院区在2018年1月至2019 年12月期间，每月随机采集急性呼吸道感染（ARTI）儿科患者的咽拭子样本，总共1 674份，采用多重实时荧光逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法，筛查HPIV-3阳性样本。采用巢式PCR方法扩增HPIV-3阳性样本HN全长基因并进行序列测定，序列结果与GenBank中HPIV-3的代表株进行对比分析，建立系统进化树。结果显示，1 674份咽拭子样本中，HPIV-3阳性有90份，检出率为5.37%，其中，6岁以下儿童占97.78%（88份）。HPIV-3阳性病例主要分布在春季和夏季。通过巢式PCR方法扩增得到44株HPIV-3 HN基因全长序列，序列比对及进化分析表明，HPIV-3 HN基因属于C3基因亚型的C3a和C3b分支，其中，C3a亚型有30株，C3b亚型有14株。44株青岛分离株之间的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.0%~100.0%和98.5%~100.0%。综上，2018至2019年间，HPIV-3 C3基因型的C3a和C3b分支在山东省青岛市地区循环流行，其HN基因型变异较小，进化上具有一定的地域特征。

目的:探讨MLL-AF4融合基因阳性在初治急性淋巴细胞白血病（ALL）中的发生情况，分析MLL-AF4融合基因阳性ALL患者的临床特征及预后情况。方法:回顾性分析驻马店市中心医院2010年2月至2021年2月收治的455例原发初治ALL患者的临床资料。采用荧光原位杂交检测患者是否存在MLL基因重排，采用多重巢式反转录聚合酶链反应检测患者MLL-AF4融合基因阳性发生情况，比较MLL-AF4融合基因阳性与阴性患者的临床特征及预后。结果:455例原发初治ALL患者中，MLL基因重排阳性30例（6.6%），其中MLL-AF4融合基因阳性21例（MLL-AF4阳性组），MLL-ENL融合基因阳性6例，MLL-AF9融合基因阳性2例，MLL-AF10融合基因阳性1例。随机选取同期未检出任何融合基因的60例ALL患者作为MLL-AF4阴性组。MLL-AF4阳性组的肝或脾大、中枢神经系统（CNS）侵犯者比例及中位外周血白细胞计数、中位外周血幼稚细胞绝对值均高于MLL-AF4阴性组（均 P<0.05）。MLL-AF4阳性组与阴性组化疗第15天完全缓解率分别为81.0%（17/21）、90.0%（54/60）（ χ2＝0.49， P＝0.484），3个月累积复发率分别为38.1%（8/21）、13.3%（8/60）（ χ2＝4.56， P＝0.033）。MLL-AF4阳性组总生存差于MLL-AF4阴性组（ χ2＝5.93， P＝0.015）。 结论:MLL-AF4融合基因阳性ALL患者较阴性患者初诊时肿瘤负荷高，复发率高，总生存率低，预后较差。

目的:探讨我国东北地区伊马替尼耐药的慢性粒细胞白血病（CML）和费城染色体阳性急性淋巴细胞白血病（Ph + ALL）患者BCR-ABL1激酶区突变的特征及其对预后的影响。 方法:回顾性分析2013年1月至2018年10月就诊于吉林大学第一医院的252例CML患者和49例Ph + ALL患者的临床资料，患者均在伊马替尼治疗效果不佳时采集骨髓或者外周血标本。应用巢式聚合酶链反应（PCR）扩增BCR-ABL1激酶区，应用Sequencing Analysis v5.4软件分析BCR-ABL1激酶区突变。随访6~48个月，进行生存分析。 结果:252例CML患者中57例（22.6%）检测出BCR-ABL1激酶区突变，其中25例处于慢性期，21例处于加速期，11例处于急变期；50例患者存在20种类型单一点突变，最常见的类型为E255K（16.0%，8/50）、T315I（14.0%，7/50）、M244V（8.0%，4/50）、G250E（8.0%，4/50），突变位点主要集中在P-loop和C-helix区；7例患者存在双重突变；发生多重突变的患者预后最差，中位总生存（OS）时间3.2个月。49例Ph + ALL患者中17例（34.7%）检测出BCR-ABL1激酶区突变，其中14例患者存在12种类型单一点突变，3例患者存在多重突变；多重突变、突变位于P-loop和C-helix区、突变位于其他区域患者的中位OS时间分别为2.0、8.0、18.0个月，3组患者OS差异有统计学意义（ P<0.01）。 结论:我国东北地区伊马替尼耐药的CML和Ph + ALL患者中，发生于P-loop和C-helix区的点突变最为常见。多重突变、发生在P-loop和C-helix区的突变与患者不良预后相关。

目的:探讨贝林妥欧单抗治疗儿童复发/难治CD19+急性B淋巴细胞白血病(R/R CD19+ B-ALL)的疗效及安全性。方法:选择2021年3月至2022年7月郑州大学附属儿童医院收治的使用贝林妥欧单抗方案治疗的6例R/R CD19+ B-ALL患儿(患儿1~6)为研究对象。评估其使用贝林妥欧单抗治疗的疗效、安全性和主要结局指标，包括骨髓细胞形态学检查、微小残留白血病(MRD)、融合基因，贝林妥欧单抗治疗相关不良反应等。本研究遵循的程序符合郑州大学附属儿童医院伦理委员会制定的伦理学标准，得到该委员会批准(伦审号：2021-H-K43)，所有患儿的治疗方案均取得患儿监护人的知情同意。结果:对患儿1~6采用贝林妥欧单抗治疗的疗效、安全性和主要结局指标如下。①多重巢式聚合酶链反应(PCR)检测骨髓细胞检查融合基因结果：患儿1~6中，共检测到4种常见融合基因表达，包括患儿1、2、6的E2A-PBX1基因和患儿4的TEL-AML基因、患儿5的MLL-AF10基因、患儿3的BCR/ABL。②疗效：治疗前，3例(患儿1、2、6)患儿骨髓细胞形态学缓解，骨髓MRD及融合基因阳性，治疗后，2例(患儿1、2)骨髓MRD及融合基因均转阴，1例(患儿6)均未缓解；治疗前，1例(患儿3)患儿骨髓细胞形态学缓解、MRD<0.01%及融合基因呈阳性，治疗后，融合基因转阴；治疗前，1例(患儿4)骨髓细胞形态学缓解、MRD呈阳性及融合基因呈阴性，治疗后，MRD转阴；治疗前，1例(患儿5)骨髓细胞形态未缓解、MRD及融合基因呈阳性，治疗后，均有下降但未达到完全缓解(CR)。③治疗安全性：患儿1~6患儿在贝林妥欧单抗输注后3 d内均出现发热，考虑为1~2级细胞因释放综合征(CRS)。其中2例(患儿4、5)减低剂量后发热消退；1例(患儿4)在输注第3天出现发热未进行剂量调整时，出现发热抽搐，停药后抽搐停止，体温恢复正常。结论:贝林妥欧单抗对儿童R/R CD19+ B-ALL有效，尤其是对于骨髓形态缓解、骨髓MRD呈阳性的患儿疗效更显著，为后续桥接异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)提供机会。该治疗的主要不良反应为发热，但是减低剂量后发热可缓解，未监测到药物导致的严重不良反应。

目的 探讨儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)常见遗传学异常及其与早期治疗反应的关系.方法 应用染色体核型分析、多重巢式反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光原位杂交(FISH)技术对2010年12月至2011年12月首都医科大学附属北京儿童医院血液肿瘤中心收治的169例初诊ALL患儿进行遗传学检查,并观察遗传学异常与早期治疗反应的关系.结果 169例ALL患儿骨髓细胞标本培养成功162例,培养成功率95.9％,其中88例具有克隆性染色体异常,异常核型检出率为52.1％.接受RT-PCR检查的153例患儿中,55例检测出携带8种融合基因,异常检出率为35.9％.应用FISH技术对40例ALL患儿进行混合谱系白血病(MLL)基因重排检测,6例阳性.将常规细胞遗传学与RT-PCR和FISH结果联合分析,105例具有遗传学异常,使异常检出率提高到62.1％.将ALL患儿遗传学异常分为6个组:t(12;21)、t(1;19)、t(9;22)、MLL基因重排、超二倍体和-6/6q-及-7/7q-,6组遗传学异常在3种不同早期治疗反应中,即第8天泼尼松诱导试验、第33天骨髓和微小残留病的结果中,差异均具有明显的统计学意义(x2=22.954、19.432、14.045,P=0.001、0.001、0.016).结论 常规细胞遗传学联合RT-PCR、FISH技术,可以提高儿童ALL遗传学异常的检出率,将遗传学异常与患儿早期治疗反应联合分析,可以更好地指导临床治疗,并进行预后评估.

目的 分析伴有EVI1基因表达的儿童急性髓系白血病(AML)的临床特点、疗效及预后.方法 采用多重巢式反转录聚合酶链反应(RT-PCR)对2009年1月至2011年12月收治的AML患儿进行融合基因检测,确定EVI1的表达情况,并追踪其临床特征及疗效,并与EVI1(-)组AML患儿进行对比分析.结果 EVI1基因在83例AML患儿中的表达率为15.65％(13/83例),在高危患儿中表达率最高,且易伴有复杂核型、MLL重排、-7等预后不良的细胞分子遗传学改变.EVI1(+)组诱导缓解率为45.5％,明显低于EVI1(-)组(79.3％)(x2=5.497,P＜0.05),尤其1个疗程达到缓解者比率显著低于EVI1(-)组(18.2％比63.8％x2=7.828,P＜0.01).虽然2组病死率无显著差异,但是EVI1(+)组早期病死率显著高于EVI1(-)组(45.5％比8.6％,P＜0.01).EVI1(+)组4年无事件生存率(EFS)显著低于EVI1(-)组[(21.2±13.8)％比(60.2±9.1)％x2=4.493,P＜0.05].而EVI1(+)组4年累积总生存率亦显著低于EVI1(-)组[(32.4±7.1)％比(63.3±10.9)％x2=4.602,P＜0.05].通过多因素及单因素二分类Logistic回归分析显示,EVI1阳性与否与预后均无显著相关性.结论 EVI1基因阳性表达的AML患儿病情进展快,缓解率低,早期病死率高,EFS低,故EVI1基因表达是儿童AML预后不良的一项指标,但尚不能作为独立预后不良因子.

腺病毒是儿童时期呼吸道感染的重要病因,重症腺病毒肺炎常发生于婴幼儿或免疫功能障碍的人群,6月～2岁为高发年龄.临床症状以高热、面色苍白、精神差、呼吸窘迫或喘息等为主,发热可持续4～7d或更长,肺外严重并发症以心血管和肝功能障碍常见.症状类似于重症细菌感染,但抗生素治疗无效,病死率高.急性期影像学以肺部非对称性渗出病变、部分渗出融合与间质气肿为主.但快速识别腺病毒感染仍然是临床的难点,采用多重巢式聚合酶链反应等有助于诊断.合适氧疗与器官功能支持是现阶段主要治疗策略.体外膜肺氧合作为重要的挽救性治疗需要进一步探索.

目的 探讨病原体快速检测技术在儿童重症肺炎中的应用.方法 2017年1月至2018年6月,对我院PICU收治的重症社区获得性肺炎患儿入PICU 24 h内进行痰液病毒和支原体检测,对其中65例患儿痰样本采用呼吸道测试条(respiratory panel,R-Panel)进行自动巢式多重聚合酶链反应检测17种呼吸道病原,并与常规方法(免疫荧光及胶体金试验)比较.结果 65例重症肺炎患儿病原学检测结果:(1)常规方法检测总体阳性率23. 08%(15/65),共获取病原15例次,其中病毒阳性13例次、肺炎支原体阳性2例次. (2)R-Panel 2 h内获取检测结果,总阳性率为58. 46%(38/65),共获得病原51例次,包括病毒46例次、支原体5例次;其中,人鼻病毒/肠病毒检出率最高,占23. 08%(15/65);其次,腺病毒检出阳性率为15. 38%(10/65);12例患儿同时检测出2种或2种以上病原菌,检出阳性率为18. 46%(12/65);(3)R-Panel检测腺病毒阳性率显著高于常规方法(15. 38 %比4. 62%,χ2 ＝4. 188,P＝0. 041);R-Panel检测腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3型、肺炎支原体灵敏度明显高于常规方法(100. 00%比30. 00%,χ2 ＝107. 692;50. 00%比16. 67%,χ2 ＝24. 442;100. 00%比80. 00%,χ2 ＝22. 222;100. 00%比40. 00%,χ2 ＝85. 714),差异均有统计学意义(P均<0. 001).结论 R-Panel进行自动巢式多重聚合酶链反应检测儿童重症社区获得性肺炎病原,与常规检测方法比较能快速获取结果、灵敏度高,对及时治疗策略的制定具有参考价值.

目的 比较HIV抗病毒治疗药物EFV与NVP治疗失败后基因型耐药突变位点及相关人口学信息分布的差异性.方法 采用基因型耐药检测方法,通过反转录巢式聚合酶链反应(RT-nested-PCR)扩增血浆病毒载量大于1000 copies/ml的2014-2016年HIV抗病毒治疗失败患者Pol区基因,将扩增序列提交至斯坦福大学耐药检测网站进行比对获得耐药报告,应用多重对应分析方法,比较EFV和NVP耐药突变与人口学信息相关性差异.结果 使用含EFV和NVP治疗失败患者共1134例,K103N/S、V106I/M、V179D/E、Y181C/I/V、Y188LHC及G190A/S/E等为NNRTIs常见突变方式.单因素分析显示,接受含此两种药物方案治疗出现的基因型耐药在患者治疗时长、性别、突变出现及传播途径的差异有统计学意义(P<0.05),与病毒载量及CD4+T淋巴细胞计数的差异无统计学意义(P>0.05).结论 使用EFV方案男性静脉药瘾感染者治疗早期(<12月)极易出现V179D/E及V106I/M突变,在治疗中期(13-24月)则易出现K103N/S,对男性静脉药瘾者在治疗24个月内的服药依从性应给予更多的关注.NVP女性长期治疗(>25月)过程中,更易出现Y181C/I/V、Y188LHC及G190A/S/E等耐药突变方式,应加强对这一人群NVP耐药的监测.