目的 测定去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)在N-二硝基亚乙胺(DEN)诱导大鼠原位肝癌模型(DEN-HCC-Rat)和原位移植大鼠肝癌模型(OTT-HCC-Rat)中的表达.方法 DEN-HCC-Rat造模:模型组SD大鼠按照20 mg·kg-1 ig 0.25％DEN水溶液,每周1次,0.025％DEN水溶液供动物饮用;对照组每周ig 1次0.9％氯化钠溶液,灭菌水供动物饮用,于造模第4、10、18、22周取材.OTT-HCC-Rat造模:模型组SD大鼠肝叶注射N1-S1细胞,假手术组大鼠麻醉后给予微创缝合处理,于注射后14 d取材.HE染色观察肝组织病变;通过免疫组化、免疫荧光、Western blotting和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验检测各组ASGPR表达及分布.结果 通过HE染色确定DEN-HCC-Rat和OTT-HCC-Rat造模成功.在DEN-HCC-Rat 中,免疫组化、免疫荧光、Western blotting、qRT-PCR结果均显示,与对照组比较,模型组大鼠肝组织ASGPR表达显著上调(P＜0.05、0.01),且呈时间相关性;在O TT-HCC-Rat中,免疫组化结果显示模型组ASGPR表达显著高于假手术组(P＜0.05),免疫荧光、Western blotting、qRT-PCR结果显示ASGPR在模型组与假手术组之间无显著性差异.结论 DEN-HCC-Rat模型更好地模拟肿瘤微环境改变,且ASGPR在肝癌区域表达高于对照组大鼠肝脏,故可利用ASGPR介导肝靶向制剂的转运,提高肝靶向药物治疗效果.

目的:研究槲芪方加减对肝癌化疗栓塞术后大鼠一氧化氮合酶(iNOS)、血管内皮生长因子(VEGF)、乏氧及免疫功能的影响.方法:50 只大鼠中随机抽取 12 只作为健康组进行对照,37 只大鼠建立肝癌模型.建模过程中意外死亡 1 只大鼠,剩余 36 只大鼠建模成功,随机分为模型组、肝动脉化疗栓塞术组以及联合组,每组 12 只.肝动脉化疗栓塞术组给予肝动脉化疗栓塞术(TACE)治疗;联合组在肝动脉化疗栓塞术组基础上给予模型大鼠27 ml/kg槲芪方灌胃,2 次/d,共 24 周.运用全自动生化分析仪检测各组大鼠肝功能指标水平,流式细胞仪检测各组大鼠免疫功能指标水平,苏木精-伊红(HE)染色观察各组大鼠肝组织病理变化,原位末端标记法(TUNEL)检测各组大鼠肝癌细胞凋亡,免疫印迹检测各组大鼠 VEGF、iNOS、缺氧诱导因子 1α(HIF-1α)蛋白表达.结果:与健康组比较,模型组丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)水平均升高(P<0.05),与模型组比较,肝动脉化疗栓塞术组 ALT、AST、ALP水平均降低(P<0.05),肝动脉化疗栓塞术组 ALT、AST、ALP 水平均高于联合组(P<0.05).与健康组比较,模型组CD3+、CD4+、CD4+/CD8+降低,CD8+升高(P<0.05),模型组与联合组比较差异无统计学意义(P>0.05),与模型组及联合组比较,肝动脉化疗栓塞术组 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+降低,CD8+升高(P<0.05).与健康组比较,模型组细胞凋亡率升高(P<0.05),与模型组比较,肝动脉化疗栓塞术组细胞凋亡率降低(P<0.05),肝动脉化疗栓塞术组细胞凋亡率低于联合组(P<0.05).与健康组比较,模型组VEGF、iNOS、HIF-1α表达均升高(P<0.05),与模型组比较,肝动脉化疗栓塞术组 VEGF、iNOS、HIF-1α表达均升高(P<0.05),与肝动脉化疗栓塞术组比较,联合组 VEGF、iNOS、HIF-1α表达均降低(P<0.05).结论:槲芪方加减可提高肝癌TACE术后大鼠的免疫功能,通过抑制肝癌大鼠乏氧微环境中 HIF-1α、iNOS及 VEGF水平,改善乏氧微环境,促进肿瘤细胞凋亡.

目的 探讨过表达Beclin1蛋白对小鼠肝癌化疗增敏的效果.方法 对照细胞核Beclin1过表达细胞株分别建立移植瘤模型30只,待肿瘤生长后,每种细胞株模型取15只经腹腔注射吉西他滨50 mg/kg,每周2次,共4周,根据治疗方式不同分为对照组、Beclin1组、化疗组和实验组.分析4组小鼠肿瘤生长,采用Western blot分析两组小鼠肿瘤组织中自噬相关蛋白p62和微管相关蛋白1轻链3(LC3)以及凋亡相关蛋白p53、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase)-3、B细胞淋巴瘤/白血病-2相关X蛋白(bax)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)等因子的变化水平;采用原位缺口末端标记法(TUNEL)染色法分析两组小鼠肿瘤细胞凋亡水平.结果 与对照组比较,化疗组、Beclin1组和实验组大鼠肿瘤体积明显减小,差异有统计学意义(F=2.418,P=0.023;F=2.019,P =0.031;F=3.140,P=0.005).与化疗组和Beclin组比较,实验组小鼠肿瘤体积明显减小,差异有统计学意义(F=2.013,P =0.037,F=2.134,P=0.032).与对照组(5.12±1.12)比较,化疗组、Beclin1组肿瘤细胞凋亡指数(10.33 ±3.12;9.43 ±2.98)显著增加,差异有统计学意义(t=2.189,P=0.016;f=1.980,P=0.020);与化疗组和Beclin组比较,实验组肿瘤组织细胞凋亡指数(21.44±4.98)明显增加,差异有统计学意义(=3.109,P=0.000).结论 过表达BECN1可诱导自噬发生,过度自噬可使细胞发生凋亡,与吉西他滨联合治疗肝癌可达到增强化疗疗效的作用.

目的 观察他克莫司对二乙基亚硝胺诱导同种肝细胞癌模型大鼠原位肝移植术后急性排斥反应的影响.方法 雄性Lewis大鼠66只,选取其中16只设为空白对照组,再选取其中50只大鼠为受体.采用二乙基亚硝胺灌胃诱导受体大鼠肝癌模型,成模后用改良双袖套法将40只正常供体DA大鼠肝脏移植于受体.术后随机分为模型对照组和他克莫司组.术后他克莫司组用他克莫司1.0 mg(kg·d)混悬液灌胃,空白对照组和模型对照组按1.0 mg/(kg·d)灌生理盐水.采用酶联免疫法(ELISA)于2周和4周检测肝组织白介素-2(IL-2)、IL-4、IL-12、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子 α(TNF-α)及转化生长因子 β1(TGF-β1);流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群T细胞(Treg)、CD4+T细胞和CD8+T细胞占T淋巴细胞的比率.结果 与空白对照组比较,模型对照组在2周和4周IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ、TGF-β1、TNF-α、CD4+T％、CD8+T％均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与模型对照组比较,他克莫司组在2周和4周IL-2、IL-4、IL-12、IFN-γ、TGF-β1、TNF-α、CD4+T％、CD8+T％均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);且他克莫司组2周时与模型对照组比较各指标明显降低(P<0.05);4周时与同组治疗2周比较各指标明显降低(P<0.05).结论 他克莫司可降低二乙基亚硝胺诱导肝细胞癌模型大鼠原位肝移植术后急性排斥反应,具有明显的免疫抑制作用.

目的 观察血管内皮生长因子C(VEGF-C)抗体与超顺磁性氧化铁颗粒(USPIO)连接的靶向分子探针(VEGF-C-US-PIO)在大鼠肝细胞癌(HCC)模型体内的MR成像特点,并探讨其临床意义.方法 采用诱导法建立大鼠原位肝癌模型,将30只SD大鼠随机分为实验组(n=20)和对照组(n=10).分别于鼠尾静脉注射靶向探针VEGF-C-USHO和非靶向探针USPIO,并于注射前及注射后1h对大鼠行MR扫描成像,测量其肝脏肿瘤与周围肝组织的T2WI信号强度,计算噪声比(CNR),比较增强前后2组之间CNR的差异.扫描结束后取动物肝脏进行HE染色明确大鼠肝癌病理类型;普鲁士蓝染色验证肿瘤组织细胞中铁含量;免疫组化染色验证肝癌组织中VEGF-C的表达情况.实验组与对照组间的比较采用独立样本t检验,实验组或对照组内注射对比剂前后的比较采用配对样本t检验.结果 30只大鼠全部诱癌成功,病理学诊断为HCC,成瘤率100％.实验组注射靶向对比剂VEGF-C-USPIO后1h与注射前CNR比较,差异有统计学意义(2.11 ±0.23 vs 3.47±0.45,t=-13.15,P＜0.001);对照组注射非靶向对比剂USPIO后1h与注射前CNR之间差异无统计学意义(3.51 ±0.14 vs 3.82 ±0.61,t=-1.40,P=0.192);2组大鼠注射对比剂后的CNR比较,差异有统计学意义(=17.60,P＜0.001).对大鼠肝脏标本行HE染色,结果证实为HCC;免疫组化染色显示,VEGF-C主要在肝癌细胞胞膜及胞浆中表达;普鲁士蓝染色显示,实验组肿瘤组织内蓝染铁颗粒较对照组明显增多.结论 所合成的分子靶向探针VEGF-C-USPIO对大鼠HCC模型具有较好的主动靶向作用,能够通过MR信号强度的变化实现HCC的特异性成像,为HCC的早期诊断提供影像学依据.

目的:观察他克莫司(FK506)对大鼠肝细胞癌模型肝移植术术后免疫功能的影响.方法:雄性Lewis大鼠76只,DA大鼠48只.选取其中60只Lewis大鼠用二乙基亚硝胺灌胃构建肝癌模型,14周后将48只正常DA大鼠肝脏移植于造模后存活的48只肝癌模型大鼠,术后随机分为模型组,FK506高、中、低剂量组(n=12);另16只正常雄性Lewis大鼠作为正常对照组.术后FK506治疗组分别以1、0.5和0.25 mg/kg剂量灌胃4周,正常对照组和模型组给予0.9％氯化钠溶液.于治疗2周和4周时采用ELISA法分别检测外周血一氧化氮(nitric oxide,NO)及肝组织白介素-2β(Interleukin-2β,IL-2β)、IL-4 β、IL-12β、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、转化生长因子-βl(Transforming growth factor beta,TGF-β1)及肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-α)水平;采用流式细胞仪检测Treg、CD4+T、CD8+T细胞数;RT-PCR方法检测肝脏诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因表达.结果:FK506中、高剂量组IL-2β、IL-4β、IL-12β、NO、IFN-γ、TGF-β1、TNF-α、CD4+T％、CD8+T％在治疗2周和4周时均明显降低,iNOS mRNA低表达,与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05),治疗4周时与同组治疗2周时比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论:FK506对二乙基亚硝胺诱导肝细胞癌模型大鼠原位肝移植术后急性排异反应具有明显的抑制作用,这一作用主要是通过调节Treg类细胞因子及NO信号通路蛋白而实现.

[目的]基于TLR4/MyD88/NF-κB信号通路探讨右美托咪定对肝癌切除术大鼠免疫功能的影响.[方法]采用肝包膜下植入肝癌组织建立大鼠原位肝癌模型,并以随机数字表法将24只原位肝癌SD大鼠分为对照组(C组)和右美托咪定低、中、高剂量组(DL组、DM组、DH组),每组6只大鼠.右美托咪定组大鼠于麻醉诱导前15min内静脉输注右美托咪定,麻醉诱导插管后,持续静脉输注右美托咪定至实验结束,对照组则静脉输注等量生理盐水.各组分别于术前(T0)、术后2d(T1)和术后5d(T2)采集尾静脉血.采用流式细胞仪测定T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+水平,计算CD4+/CD8+;采用ELISA法检测血浆白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-17A(IL-17A)及干扰素-γ(IFN-γ)的浓度;T2取血后,处死大鼠,观察脾组织病理变化,并运用Western blot检测脾组织中TLR4、MyD88、NF-κB p65蛋白表达.[结果]在T1和T2时,DH组CD3+、CD4+T细胞数量均比C组显著提高(T1:45.80±8.95 vs 26.03±8.45,P＜0.05;19.73±3.23vs10.00±2.95,P＜0.01;T2:45.70±5.41 vs 23.77±5.98,15.30±3.15vs8.73±2.80,P均＜0.05),CD8+T细胞数量则降低,但无显著差异(P＞0.05).IL-2、IL-17A和IFN-γ水平显著提高(T1:53.72±1.32 vs 51.89±1.19,P＜0.05;225.16±2.46 vs 216.80±2.77,P＜0.01;1556.02±20.72 vs 1528.55±19.77,P＜0.05;T2;53.30±1.35vs49.93±1.28,P＜0.01;223.57±2.55 vs 211.42±2.61,P＜0.01;1553.81±21.24 vs 1524.72±15.65,P＜0.05),IL-10水平降低(T1:145.56±1.50 vs 155.36±1.19;T2:148.51±1.39 vs 166.26±2.12,P均＜0.01).与T0时比较,各组在T1、T2时CD3+、CD4+T细胞数量均降低,CD4+/CD8+升高,CD8+T细胞数量升高.T2时,C组和DL组的IL-2、IL-17A水平均显著降低(C组:49.93±1.28 vs 56.02±0.98,211.42±2.61 vs 226.77±2.59,P均＜0.01;DL组:50.77±0.83 vs 55.02±1.13,P＜0.01;219.67±2.03vs 225.82±2.64,P＜0.05),IL-10水平显著升高(166.26±2.12 vs 146.28±1.50,155.40±1.57 vs 143.59±1.19,P均＜0.01),各组在T1、T2时IFN-γ水平无显著变化.病理结果显示,与C组相比,右美托咪定组脾脏中成熟淋巴细胞数量增加,白髓面积相对扩大.Western blot结果显示,右美托咪定呈剂量依赖性显著下调TLR4、MyD88和NF-κB p65的表达.[结论]右美托咪定可改善原位肝癌切除术大鼠术后细胞免疫功能抑制,可能是通过阻碍TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活而发挥免疫调节作用.

目的 评价二乙基亚硝胺(DEN)口服诱导的大鼠肝癌模型的病理学特性及其在经导管动脉化疗栓塞术(TACE)中的应用价值.方法 60只Sprague-Dawley(SD)大鼠口服0.01％DEN诱导原位肝癌,分为肿瘤模型组(n=40)和TACE应用组(n=20).肿瘤模型组大鼠自诱导后第6周开始每周行肝脏MRI检查,肝脏出现0.2 cm、0.5 cm结节时分别随机处死5只大鼠,行肝脏大体观、苏木精-伊红(HE)及Masson染色检查;其余大鼠继续每周行肝脏MR及每2周肺部CT检查,观察肿瘤生长、转移,并记录大鼠生存时间.TACE应用组大鼠采用开腹经胃十二指肠动脉逆行插管行介入操作,记录技术成功率和死亡率;术后3d、7 d分别处死大鼠,检测肿瘤坏死.结果 肿瘤模型组大鼠肿瘤结节直径达0.2 cm的中位诱导时间为8(7,10)周,肝脏体积增大,肿瘤呈灰白色微小结节;HE染色显示肝实质炎性细胞浸润,部分假小叶形成,肿瘤细胞核肥大深染;Masson染色显示少量胶原纤维.肿瘤结节直径达0.5 cm的中位诱导时间为11(10,12)周,肝脏体积缩小,表面有大量结节;HE染色可见假小叶形成;Masson染色显示胶原纤维增多.部分大鼠出现肝外转移.中位生存时间为诱导后13(8,20)周.TACE应用组大鼠经DSA证实肿瘤为富血供;TACE技术成功为11/16,手术相关死亡为3/16;术后3 d、7 d肿瘤坏死率分别为(48.16±2.65)％、(50.36±2.92)％.结论 DEN诱导的大鼠原位肝癌较好地模仿了人类肝癌组织病理学特性,可用于TACE操作,是一种理想的介入治疗动物模型.