目的:分析2013—2020年人感染H7N9禽流感密码子使用偏好及其影响因素。方法:通过NCBI数据库获得病毒全基因组序列，使用CodonW、EMBOSS、R、Origin 9.0、SPSS 20.0等软件分析病毒的碱基构成、密码子偏好性参数等。结果:H7N9病毒全基因组AU含量高于GC，且AU多出现在密码子末位。2013—2020年AU含量逐渐升高，而GC含量逐渐降低。病毒有效密码子数在48.71~56.17之间，提示病毒密码子使用偏性总体较弱。有效密码子数绘图和密码子适应指数分析显示病毒密码子使用偏好受自然选择和突变压力双重影响，自然选择因素更为明显。结论:人感染H7N9禽流感病毒密码子使用偏好仍处在不断适应人类宿主的演化过程中，第五波疫情及后续毒株与既往毒株相比存在更加适应宿主的变化。

目的 分析马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)基因组密码子使用偏爱性及其影响因素,为疫苗及特异性抗体的制备提供参考.方法 使用EMBOSS以及Codon W、SPSS 26.0等软件对GenBank数据库中93条MARV编码序列进行分析,用SigmaPlot14.0、Graphpad Prism 9.5软件进行绘图.结果 MARV7种蛋白ENC均值分布在49.84～60.92之间,CAI值接近0.7.RSCU结果显示GCA、AGA、AAU、GAA、GGA、AUU、CCU、ACA是7种蛋白的共有高频密码子,其中具有偏爱性的密码子多以A/U结尾.中性分析、ENC-Plot分析和PR2奇偶分析表明MARV密码子使用偏爱性是由突变压力、自然选择和其它多种因素共同作用形成的,其中自然选择占主导作用.将MARV密码子使用频率与大肠埃希菌、酵母、人和杆状病毒4种常见表达系统进行比较,发现MARV与大肠埃希菌密码子使用频率更为接近.结论 MARV密码子使用偏爱性由多种因素共同作用形成的,自然选择占主导作用.大肠埃希菌表达系统更适合作为马尔堡病毒蛋白的体外表达.

目的:分析冠状病毒基因中密码子的进化和变异.方法:运用生物信息学方法和生物统计学方法,对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)和非典病毒(SARS)基因中密码子使用的偏好性和密码子的上下文关系进行比较分析.结果:两种病毒密码子的使用都存在显著的偏好性(RSCU值的变化为0.10～2.67),且偏好使用的密码子(偏爱密码子)和避免使用的密码子(稀有密码子)基本是一致的;通过相关性分析发现在两种病毒中密码子适应性指数(CAI)与密码子第三位点的GC含量(GC3)呈显著的负相关性,但SARS-CoV-2的负相关性更强(SARS-CoV-2:R2=0.76,P＜0.001;SARS:R2=0.48,P＜0.001),随着CAI的增大,GC3降低由于CAI是反映基因表达水平的参数,即高表达基因偏好低GC3的同义密码子.比较偏爱密码子和稀有密码子的上下文关系,发现偏爱密码子与稀有密码子各位点的核苷酸组分存在显著差异,这种差异性表现为在密码子不同位点GC和AT的显著区别,反映了GC含量对同义密码子使用偏爱性的约束.结论:SARS-CoV-2和SARS病毒基因组GC含量、密码子的上下文关系、密码子各位点核苷酸的组分、基因的表达水平是影响密码子偏爱性的重要因素,研究结果对SARS-CoV-2和SARS病毒基因组的进化和变异的研究具有参考意义.

DHA和EPA对心脑血管疾病以及癌症等疾病的防治有着重要的作用,其中ω?3和ω?6脂肪酸脱氢酶是合成多不饱和脂肪酸DHA和EPA过程中的两个关键的去不饱和酶,由于缺乏这两种酶的基因,高等动物无法自发合成多不饱和脂肪酸,为了得到可以生产多不饱和脂肪酸的转基因动物,本研究计划将大豆的这两个去饱和脂肪酸作为目的基因,但由于不同物种之间的密码子使用具有偏爱性,会严重影响到目的基因在宿主体内的表达水平,为了解决这一问题,提高目的基因在宿主体内的表达水平,同时采用Jcat在线软件和手动替换密码子两种方法对大豆的ω?3和ω?6脂肪酸脱氢酶基因进行了优化,然后选出最优的优化方法,为后期进一步的实验提供目的基因.最后本文预测了两种优化结果的RNA二级结构和CAI、CBI、Nc值和GC含量,比较得出手动替换的结果优于在线优化的结果.

目的 构建重组核酸酶原核表达载体,并检测其表达情况.方法 根据GenBank公布的黏质沙雷菌胞外核酸酶(Serratia marcescens nuclease,SM nuclease)基因序列(M19495.1),去除其N-端信号肽序列,使用大肠埃希菌偏爱性密码子,设计并合成带有核酸酶基因的Ben-pGH.以核酸酶基因全长为模板,PCR法扩增该基因,将其与经Nco I和Xho I双酶切的A10-pET-32a-c(+)载体连接,连接产物转入E.coli Top10中,经菌液PCR筛选阳性克隆,并进行DNA测序.将Ben-pET-32a-c(+)转入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE鉴定.结果 Ben-pET-32a-c(+)中核酸酶基因与GenBank公布的SM nuclease基因的同源性为82％.表达的重组核酸酶以包涵体形式存在,相对分子质量为30 000,表达量约占菌体总蛋白的84.45％.结论 成功构建了重组核酸酶原核表达载体,并获得稳定表达.

目的 探索H5N8流感病毒相关蛋白的密码子偏爱性及其变化趋势. 方法 运用CUSP、CodonW等生物信息软件对2000年以来的H5N8流行株相关蛋白的编码序列进行密码子偏爱性分析,并以重要的人类流感病毒作为参照进行聚类分析. 结果 H5N8流感病毒相关蛋白的有效密码子数目(ENC)值均较高,密码子偏性总体较低;相关蛋白的偏爱密码子有差异性.ENC Plot及中性分析显示,H5N8在进化过程中主要受自然选择因素的影响.聚类分析显示,除NA蛋白的密码子偏爱性相对稳定外,其他蛋白在2010、2014、2016年流行株发生了明显改变. 结论 近年来H5N8在环境压力下发生快速突变,其跨物种感染人的风险进一步加强,而NA密码子偏爱性变化可能是监测的重点.

[背景]小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病,严重威胁我国养羊业的发展.[目的]原核表达PPRV H蛋白,并制备其多克隆抗体.[方法]根据GenBank中PPRV西藏株h基因序列,对其进行密码子大肠杆菌偏爱性优化,采用两步PCR法全化学合成全长h基因.将测序验证正确的h基因克隆至原核表达载体pET-28a、pET-30a、pET-32a,转化E.coli BL21(DE3)并利用IPTG诱导H蛋白表达.以经SDS-PAGE割胶纯化的重组H蛋白免疫新西兰大白兔制备抗PPRV H蛋白多克隆抗体.[结果]重组E.coli [pET-28a(-30a,-32a)-H]表达的重组H蛋白相对分子质量分别约为70、68和86 kD;诱导7h时PRRV H蛋白表达量最高,而且主要以包涵体形式表达;重组E.coli (pET-30a-H)表达的H蛋白经SDS-PAGE割胶纯化后免疫新西兰大白兔制备的多抗血清能与表达的重组H蛋白发生特异性反应;ELISA法检测抗体效价在1:6 400-1:25 600之间.[结论]原核表达了PPRV H蛋白,并制备了高效价的抗H蛋白多克隆抗体,为进一步研究PPRV H蛋白的功能及H蛋白的线性B细胞表位作图奠定了基础.

目的 合成适合酵母表达的EB病毒(EBV)早期弥散型抗原(EA-D)基因BMFR1,在毕赤酵母中表达;探讨表达产物在鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)血清学诊断中的应用.方法 选用酵母偏爱的密码子合成BMFR1基因转入毕赤酵母菌株表达;将重组EA-D作为包被抗原,用ELISA检测IgA;收集NPC患者以及健康体检者血清进行检测.结果 SDS电泳、免疫印迹显示EBV EA-D在毕赤酵母表达;早期和晚期NPC患者EA-D-IgA阳性检出率分别为60.0％和68.8％,高于对照组5.0％,差异具有统计学意义(P＜0.05).早期NPC患者组与晚期患者组之间差异无统计学意义(P＞0.05).该方法诊断NPC的灵敏性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为(早期NPC组/晚期NPC组):60.0％/68.8％、95.0％/95.0％、47.4％/76.7％、96.9％/92.7％.结论 毕赤酵母表达出重组EBV EA-D抗原,用表达产物建立的EA-D-IgA抗体检测方法可作为NPC诊断的辅助手段.

贻贝素(Mytilins)是一类主要在贝类血细胞中表达的阳离子小分子抗菌肽,包括多种同工型,它们在免疫系统中发挥了重要作用,Mytilin-1是其中的一种同工型.厚壳贻贝(Mytilus coruscus)Mytilin-1的一级结构由信号肽、成熟肽和C端的延伸肽组成;其成熟肽决定了Mytilin-1的生物学活性,它由34个氨基酸残基组成,其中8个保守的半胱氨酸残基在空间上能形成4对二硫键,对Mytilin-1的稳定性和活性起了关键作用.以厚壳贻贝的Mytilin-1成熟肽为重组DNA表达的目的蛋白,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子偏爱性对编码该成熟肽的密码子进行优化,合成的目的基因"mMy1"与表达载体pPICZαA连接后电转至毕赤酵母X-33,通过高浓度博来霉素筛选高拷贝酵母转化子,获得的阳性转化子在29℃、250 r/min、pH6.0的条件下,使用1％ 甲醇诱导表达96 h;培养液上清经Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析证明:重组mMy1在毕赤酵母X-33中得到成功表达,其分子量为4.8 kD.抑菌试验表明,重组mMy1对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及革兰氏阴性的大肠杆菌(Escherchia coli)具有抑菌活性.

Crustin是一系列富含半胱氨酸的甲壳动物来源的抗菌肽,是甲壳动物非特异性免疫机制中的重要免疫因子,其生物学功能由C端的成熟肽区域决定.参考三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)PtCrustin2成熟肽的cDNA序列,根据毕赤酵母(Pichia pastoris)的密码子偏爱性对其相关密码子进行优化,合成5''端含XhoⅠ限制性位点和Kex2信号肽酶切位点、3''端含XbaⅠ限制性位点和6×his标签的目的基因"smPtCrustin2";以pPICZαA为表达载体,构建重组表达载体pPICZαA-smPtCrustin2,将其转入毕赤酵母X-33细胞后,通过含高浓度博来霉素的抗性平板筛选高拷贝甲醇利用快速型酵母转化子;筛选获得的酵母转化子在28℃、250 r/min条件下,使用0.5％甲醇诱导表达目的蛋白,并通过固化金属离子亲和层析(IMAC)对其进行分离纯化.Tricine-SDS-PAGE分析显示:纯化的重组体smPtCrustin2的分子量约为9.6 ku,并形成分子量约20 ku的二聚体.Western Blot分析进一步证明了纯化产物为预期的目的蛋白.建立的毕赤酵母表达系统获得了表达量为22.4 mg/L的重组体smPtCrustin2.