目的:分析血清IgG N-糖链与胃癌Lauren分型的相关性。方法:对2017—2018年于复旦大学中山医院进行治疗的17例弥漫型和21例肠型胃癌患者进行回顾性分析。汇总并统计一般资料和临床特征。采用超高效液相色谱法定量检测血清免疫球蛋白G（IgG）N-糖链含量，比较血清IgG N-糖链在肠型与弥漫型胃癌之间的差异，并采用Logistic回归分析评估血清IgG N-糖链与Lauren分型的相关性。结果:IgG N-糖链分析包括27个直接检测到的糖链和4个糖链衍生性状。H为己糖，N为乙酰葡萄糖胺，F为岩藻糖，S为唾液酸。不同化疗方案之间的IgG N-糖链差异均无统计学意义。与肠型胃癌患者相比，弥漫型胃癌患者血清中H3N3F1（ t=3.785， P=0.001）、H3N4（ t=3.919， P=0.002）、H3N4F1（ t=2.770， P=0.005）、H3N5F1（ t=2.888， P=0.010）较少；H4N4F1（6）（ t=?3.488， P<0.001）、H5N4F1（ t=?3.401， P=0.003）、H5N5F1（ t=?2.303， P=0.023）、H5N4F1S1（ t=?3.068， P=0.008）较多。H3N3F1（ OR：1.20， P=0.008）、H3N4（ OR：1.32， P=0.005）、H3N4F1（ OR：1.13， P=0.017）、H3N5F1（ OR：1.78， P=0.015）、H4N4F1（6）（ OR：0.43， P=0.008）、H5N4F1（ OR：0.74， P=0.008）、H5N5F1（ OR：0.32， P=0.036）、H5N4F1S1（ OR：0.48， P=0.009）与Lauren分型显著相关。唾液酸化（ t=?2.717， P=0.012）和半乳糖化（ t=?3.400， P=0.001）的IgG N-糖链在肠型胃癌患者血清中较少。半乳糖化（ OR：0.87， P=0.007）和唾液酸化（ OR：0.62， P=0.015）与Lauren分型显著相关。 结论:部分IgG N-糖链与胃癌Lauren分型具有显著相关性，可作为辅助Lauren分型的潜在生物标志物。

目的:探讨甲状腺功能正常，亚临床甲状腺功能减退和甲状腺功能减退三种不同状态的桥本氏甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis ，HT)患者血清中甲状腺球蛋白抗体(thyroglobulin antibody ，TgAb)免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig) G糖基化修饰水平的差异。方法:收集天津市第五中心医院2016年12月至2019年8月诊断的TgAb阳性的初发HT患者96例，根据甲状腺功能不同将患者分为甲状腺功能正常组(Eu组，n＝32)，亚临床甲状腺功能减退组(sH组，n＝28)和甲状腺功能减退组(H组，n＝36)，采用抗原特异的凝集素酶联免疫吸附测定法(lectin-enzyme-linked immunosorbent assay，L-ELISA)分别检测TgAb上的岩藻糖、半乳糖及唾液酸的相对含量。结果:Eu组患者TgAb IgG的阳性率低于H组(35.7%比52.7%， P＝0.016)，但在sH组与H组中差异无统计学意义(46.8%比52.7%， P＝0.396)。Eu组，sH组和H组的TgAb末端的核心岩藻糖含量的中位数分别是18.3%，17.7%和16.8%，半乳糖含量的中位数分别是40.2%，38.4%和39.6%，唾液酸含量的中位数分别是98.4%，84.3%和89.6%，其差异均无统计学意义( P值均>0.05)。 结论:不同功能状态的HT患者TgAb IgG的糖基化修饰水平虽没有显著差异，但提示了对TgAb IgG Fc段糖基化修饰的精确研究可能是下一步探讨不同功能状态HT发生机制的方法。

目的 探究两歧双歧杆菌BD-1(Bifidobacterium bifidum BD-1,BD-1)以2-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyl-lactose,2'-FL)作为唯一碳源时,与葡萄糖相比,其菌体和代谢产物诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌细胞因子的效应,以探索BD-1菌利用母乳低聚糖后免疫调节的菌株特性.方法 (1)菌体部分干预实验:将BD-1活菌接种于不同碳源的改良MRS肉汤培养基中,改良过的MRS肉汤培养基包括以2％2'-FL作为唯一碳源(2'-FL组)和以2％葡萄糖作为唯一碳源(Glu组)的培养基.将接种后的BD-1活菌在厌氧条件下培养24h后,分离各组菌体和培养基上清液.将菌体部分与RAW264.7细胞共同培养,并以肽聚糖(pep-tidoglycan,PGN)为菌体成分对照,同时设置不添加干预物的阴性对照(Ctrl组).(2)菌体代谢产物部分干预实验:将培养基上清液与RAW264.7细胞共同培养,以含有2％2'-FL或葡萄糖但未进行BD-1菌发酵处理的培养基作为实验对照,并设置不添加干预物的培养基与RAW264.7细胞的共培养上清液作为阴性对照(Ctrl组),以PGN与RAW264.7细胞的共培养上清液作为阳性对照(PGN组).培养24h后,提取RAW264.7细胞总RNA,逆转录后采用实时荧光定量PCR检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10、IL-12、IL-1β的基因表达量;收集各组受试物与RAW264.7细胞的共培养上清液,采用酶联免疫吸附试验检测共培养上清液中上述细胞因子的分泌量.结果 (1)菌体部分干预:与PGN组相比,菌体部分2'-FL组和Glu组的TNF-α、IL-6、IL-10分泌量及基因表达量显著上升(均P＜0.05).与Glu组相比,2'-FL组的IL-6、IL-10分泌量显著下降(均P＜0.05),IL-6、IL-10的基因表达具有下降趋势.(2)菌体代谢产物部分干预:BD-1-2'-FL上清组和BD-1-Glu上清组的TNF-α、IL-6及IL-10分泌水平以及基因表达水平较2'-FL组和Glu组(未进行BD-1菌发酵处理的组别)有显著提高(均P＜0.05),而且2'-FL组中IL-6、IL-10的分泌量较Glu组显著增加(均P＜0.05),IL-6表达水平显著升高(均P＜0.05),IL-10表达水平有升高的趋势.2'-FL组相较于Glu组能产生更多的有机酸和种类更为丰富的糖类物质.结论 利用母乳低聚糖或葡萄糖作为唯一碳源培养BD-1菌体和诱导巨噬细胞分泌细胞因子的特征存在差异.当BD-1以母乳低聚糖为唯一碳源时,与葡萄糖相比,菌体成分呈现出抗炎倾向,在巨噬细胞中表现为IL-6的分泌和基因表达能力下降;而其代谢产物则具有刺激免疫激活的趋势,在巨噬细胞中导致IL-6和IL-10的分泌及基因表达能力上升.

2'-岩藻糖基乳糖(2'-fucosyllactose,2'-FL)是一种含量最丰富的人乳寡糖,微生物全细胞合成是生产 2'-FL的重要方法.乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)作为一种可直接用于乳制品的食品级微生物,目前还没有用于生产人乳寡糖的报道.首先,在两种常用L.lactis底盘NZ3900 和NZ9000 中利用含有基因fkp、futC、lacF的重组质粒pNZ8148-2f构建 2'-FL补救合成途径,在添加 10 g/L岩藻糖和 5 g/L乳糖的发酵培养基中,测得 2'-FL的摇瓶产量分别为 0.16 g/L与 0.4 g/L,结合对二者生长状况等综合分析,选取NZ9000 作为优势底盘.然后,在NZ9000 中构建 2'-FL从头合成途径,利用同源重组技术并借助L.lactis中特有的敲除整合载体pNZ5319,在敲除非必需基因upp的同时将基因manA、manB、gmd和wcaG整合到染色体上,借助载体pNZ8148-1 将基因manC、futC和lacF以质粒的形式引入到细胞中,同时利用不同启动子P32、Pnis对酶的表达水平进行组合调控.获得最优菌株NZ9000 6,在添加 20 g/L葡萄糖和 5 g/L乳糖的发酵培养基中,测得 2'-FL的摇瓶产量为 0.28 g/L.最后,在发酵培养基中对氯化高铁血红素、胰蛋白胨和酵母粉的浓度进行了优化,在添加 2.5 μg/mL氯化高铁血红素、15 g/L胰蛋白胨、6 g/L酵母粉时 2'-FL的摇瓶产量达到 1.58 g/L,为相关报道的较高水平.该研究证实了L.lactis合成 2'-FL的可行性,为 2'-FL的生产提供了新思路.

目的 探索中国人群中免疫球蛋白G(IgG)糖基化与中心性肥胖的关联.方法 采用横断面研究,整群抽样法于2012年4至7月在北京市西城区某社区,纳入517人作为研究对象,测量身高、体重、腰围、臀围,并采集血液样本,提取纯化血浆IgG,采用超高压液相色谱法进行IgG糖基组学检测.以腰臀比定义中心性肥胖,男性腰臀比>0.90,女性腰臀比>0.80划分为中心性肥胖组;男性腰臀比≤0.90,女性腰臀比≤0.80划分为正常组.腰臀比和糖基峰的关联以标准化回归系数呈现,P<0.05为差异有统计学意义.结果 517名居民平均年龄(47.81±5.58)岁,男性164人(31.70%).中心性肥胖组205例(39.65%),正常组312人(60.35%),中心性肥胖组年龄(49.21±5.70)岁高于正常组的(46.89±5.30)岁,差异有统计学意义(t=-4.73,P=0.001).男性中心性肥胖62例(37.80%),女性中心性肥胖143例(40.50%),差异无统计学意义(χ2=0.34,P=0.558).IgG糖基组学检测得到24个不同的糖基峰结构,由于糖基峰3和20受到污染和结构不明,被排除分析,余下的22个糖基峰中,GP4、GP8、GP14、GP18含量较多,4个峰的含量约占所有峰的50%.腰臀比与糖基峰中核心岩藻糖(GP10)呈正相关(b'=0.076,P=0.024),而与末端半乳糖(GP12)、末端唾液酸(GP17、GP22)呈负相关(b'=-0.076、-0.081、-0.080,P均<0.05).中心性肥胖组的GP12、GP17、GP22含量均低于正常组,差异均有统计学意义(P=0.001、0.004、0.033).结论 中心性肥胖人群IgG末端半乳糖和末端唾液酸化水平较低及核心岩藻糖的水平较高.

目的 利用超高效液相色谱串联Qda质谱法对单抗的N糖谱进行定性和定量分析.方法 对单抗Fc上的N糖链利用糖苷酶F进行酶切释放,然后用RapiFluor-MS染料进行标记,通过Qda质谱对N糖进行糖型鉴别、荧光检测器进行定量检测.结果 超高效液相色谱串联Qda质谱法能够准确的对单抗N糖进行定性定量检测,单个糖型的实测m/z值在理论值±0.5内.利用该方法对原研抗CD20人鼠嵌合单抗和生物类似药候选药物的N糖进行分析表明,3个候选药物的N糖谱与原研抗体基本一致,但在部分糖型种类和比例上存在一定的差异,总的岩藻糖修饰糖型比例基本一致.对CHO细胞、NS0细胞和SP2/0细胞表达的单抗N糖进行比对分析显示,3种细胞表达单抗的主要糖型为G0F-N、G0F、Man5、G1Fa、G1Fb和G2F,占总糖型比例的80％以上.相比于NS0细胞和SP2/0细胞,CHO细胞表达抗体糖型种类相对较为简单,共11种糖型.而NS0细胞和SP2/0细胞表达单抗糖型种类和结构较复杂,分别检测到22和26种糖型,其中含有多种复杂的唾液酸和半乳糖修饰糖型,虽然这些糖型所占比例较低,但可能与单抗的体内半衰期和免疫原性相关.结论 超高效液相色谱串联Qda质谱法作为快速准确的N糖分析方法,可应用于单抗N糖的质控研究中.

旨在调控单抗生物类似药的糖基化分布,使其与原研药一致.通过全因子设计试验考察不同浓度的半乳糖、尿苷、氯化锰和蛋白水解物对单抗糖基化修饰的影响.结果 表明,半乳糖、尿苷及氯化锰均能提高单抗半乳糖基化,且对细胞生长和单抗产量无明显影响.此外尿苷和氯化锰还能降低五聚高甘露糖型(Man5),但过量的尿苷会导致Man5增高.而蛋白水解物除了能降低Man5,提高单抗岩藻糖基化外,对细胞生长也有促进作用.选取模型预测的最优条件进行反应器培养验证,最终的单抗糖基化分布符合预期,成功建立CHO细胞单抗糖基化调控的生产策略.

为了深入理解在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞流加培养过程中氨对抗体融合蛋白表达和N-糖基化的作用,认识氨影响N-糖基化加工的作用位点,考察了在细胞维持期(产物表达期)不同氨浓度条件与CHO细胞维持与代谢、抗体融合蛋白表达和N-糖链结构的关系.结果 显示,氨浓度在5-12 mmol/L范围内对维持期的细胞生长曲线、葡萄糖和谷氨酰胺的消耗以及乳酸和氨的生成情况没有明显影响.但当氨浓度大于5 mmol/L时,随着氨浓度的升高,抗体融合蛋白的唾液酸化程度和半乳糖化程度均不断降低,而岩藻糖基化程度和高甘露糖糖型比例则没有变化.当氨浓度升高至大于9 mmol/L后,抗体融合蛋白的表达能力和最终表达量开始降低.因此,应在细胞培养工艺过程开发时控制氨的生成至小于5 mmol/L,以避免氨的累积导致产物的半乳糖化和唾液酸化程度降低以及产物表达量下降.

2'-岩藻糖基乳糖是母乳中最主要的低聚糖之一,近年来大量实验研究了2'-岩藻糖基乳糖在调节肠道菌群及免疫系统方面的作用,随着2'-岩藻糖基乳糖在体外合成的实现,临床研究也表明2'-岩藻糖基乳糖添加奶粉促进了婴幼儿免疫发育且耐受性良好.本文综述了2'-岩藻糖基乳糖在母乳中的含量、变化趋势及其健康益处,总结了现阶段2'-岩藻糖基乳糖添加奶粉的临床研究结果和当前添加到婴幼儿配方产品中的2'-岩藻糖基乳糖的生产工艺和特性,可为优化婴幼儿配方食品提供参考.

目的 探究中国六地区成熟母乳中主要母乳低聚糖(2'-岩藻糖基乳糖、3-岩藻糖基乳糖、乳酰-N-新四糖、乳酰-N-四糖、6'-唾液酸乳糖和3'-唾液酸乳糖)的含量及不同含量组母乳的比例及分布.方法 在全国六个地区招募单胎足月分娩的健康产妇,收集40-45 d的成熟乳,使用高效阴离子交换色谱偶联脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)测定了629例母乳样品中6种母乳低聚糖的含量.结果 所有母乳样品中均检出6种母乳低聚糖,含量最高为2'-岩藻糖基乳糖,中值为1915.88 mg/L,依次是乳酰-N-四糖、3-岩藻糖基乳糖、6'-唾液酸乳糖、乳酰-N-新四糖和3'-唾液酸乳糖,中值分别为701.13、443.95、301.72、112.78和105.52 mg/L.本研究显示,根据检测方法中2'-岩藻糖基乳糖的含量可划分母乳为极低含量组、低含量组和高含量组,其中极低/低含量组在乳母中的比例为22％,而高含量组约占乳母的78％,与人群中母乳非分泌和分泌型比例基本一致,且2'-岩藻糖基乳糖的含量在高、低含量组中相差约80倍.6种母乳低聚糖在六地区成熟乳中均存在显著差异(P<0.05).结论 成熟母乳中均可检测出6种母乳低聚糖,其中2'-岩藻糖基乳糖的含量高于其他五种低聚糖.