复发难治T细胞恶性肿瘤目前尚无特效药物，临床前研究及临床研究证实嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）治疗可能成为复发难治T细胞恶性肿瘤最有前景的免疫治疗手段之一，但靶向T细胞肿瘤的CAR-T尚面临巨大挑战：①无特异性靶抗原：理想状态下，靶抗原应仅表达于肿瘤细胞上，而在正常T细胞上不表达，对于T细胞恶性肿瘤来说，大多数靶抗原在正常T细胞和肿瘤T细胞均表达；②难以区分正常T细胞和肿瘤T细胞：CAR-T细胞疗法需要从患者体内分离出正常T细胞，否则很可能导致产品污染或肿瘤细胞的CAR修饰 [1]；③CAR-T细胞自相残杀：靶抗原在CAR-T细胞上的表达会导致CAR-T细胞自相残杀，而靶向正常T细胞表达的抗原会引起T细胞免疫缺陷，进而导致严重的机会性感染 [2]。本文对CAR-T细胞治疗T细胞恶性肿瘤的临床前及临床研究综述如下。

目的:对一对ABO血型鉴定困难的双胞胎进行血清学和分子机制研究。方法:采用凝胶卡法进行血型血清学试验，序列特异性引物PCR进行 ABO基因分型，DNA直接测序和克隆测序分析 ABO基因外显子和远端转录调控区(-nt3988～-nt3645)，短串联重复序列位点分析16个位点的遗传状态。 结果:该双胞胎的红细胞与抗-A、抗-A1和抗-E均表现为2＋混合凝集， ABO基因分型和外显子测序提示为 ABO*O.01.01/ABO*O.01.02基因型，微卫星增强子序列测定提示含有A基因，短串联重复序列位点特异性检测的16个位点中9个有两个以上的单倍体存在，红细胞分群后两群表型分别为：A型，CcDEe和O型，CcDee。 结论:通过血清学和分子生物学技术展示了这对双胞胎血型嵌合体的特性。

嵌合抗原受体自然杀伤细胞（CAR-NK）免疫治疗技术是一种新型抗肿瘤免疫方法。NK细胞可来源于外周血、脐带血、NK-92细胞系及诱导多能干细胞。CAR-NK细胞可非特异性识别靶抗原且无人类白细胞抗原限制性，异体输注不会引起移植物抗宿主病，对白血病、淋巴瘤及多发性骨髓瘤的原代细胞及动物模型具有较强的抗肿瘤效应，作为现货型产品在临床中具有广泛的应用前景。对CAR-NK载体构建及其在血液肿瘤中的临床初步应用和面临的挑战进行综述。

目的:建立嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗相关细胞因子释放综合征(CRS)的小鼠模型。方法:通过分子克隆及慢病毒转染技术，构建靶向人CD19分子的CAR-T细胞，采用流式细胞术检测CAR-T细胞转染效率，酶联免疫吸附试验(ELISA)法及流式细胞术检测CAR-T细胞特异性杀伤靶细胞的能力。通过尾静脉注射CAR-T细胞至荷瘤重症联合免疫缺陷裸鼠体内，小鼠分为磷酸缓冲液组、低负荷组(注射1×10 5个人淋巴瘤细胞Raji-Luc2细胞)和高负荷组(注射5×10 5个Raji-Luc2细胞)。采用动物活体成像法检测肿瘤治疗效果，ELISA法检测小鼠血清中细胞因子人白细胞介素2(IL-2)、人γ-干扰素(IFN-γ)、鼠IL-6、鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的水平。 结果:经尾静脉注射人T细胞和T细胞+OKT-3抗体后，T细胞组和T细胞+OKT-3组小鼠的健康得分分别为(1.15±0.08)分和(2.90±0.15)分，差异有统计学意义( P<0.001)。T细胞+OKT-3组小鼠血清中人IL-2、人IFN-γ、人IL-15、鼠IL-6、鼠GM-CSF水平分别为(1 064.00±50.14)、(1 285.00±193.90)、(202.4±18.76)、(1 478.00±289.20)和(350.70±42.27)pg/ml，均高于T细胞组[分别为(22.67±6.36)、(23.67±3.71)、(44.33±14.45)、(147.30±36.20)和(138.00±22.74)pg/ml，均 P<0.05]；OKT-3联合人T细胞引起小鼠血清中细胞因子人IL-2、人IFN-γ、鼠IL-6、鼠GM-CSF水平迅速升高，并伴有体温升高及体重下降。成功构建靶向CD19分子的CAR-T细胞，流式细胞术检测CAR-T细胞阳性率>30%。ELISA结果显示，在CD19抗原存在时，CAR-T19细胞与Raji、Nalm-6共孵育组细胞分泌IL-2和IFN-γ的水平分别为(561.00±37.07)、(680.30±71.27)、(369.00±25.71)和(523.00±26.31)pg/ml，均高于与K562共孵育组[分别为(55.00±20.53)和(64.00±7.55)pg/ml，均 P<0.001]。小鼠成像实验显示，小鼠成瘤后第7天经尾静脉回输活化后的CAR-T19细胞，成瘤第13天，低负荷和高负荷组小鼠肿瘤荧光强度均低于接种肿瘤的第7天，高负荷组肿瘤荧光强度由144.00±24.69减少至5.02±2.35( P＝0.005)，低负荷组肿瘤荧光强度由58.47±9.36减少至3.48±1.67( P＝0.004)。荷瘤小鼠注射CAR-T19细胞72 h后，血清中T细胞活化相关细胞因子人IL-2、人IL-15、人IFN-γ水平迅速增高，单核细胞相关因子鼠IL-16、鼠GM-CSF分泌增加，同时伴随有体温升高和体重降低等CRS典型特征。 结论:体外成功构建靶向CD19分子的CAR-T细胞，通过CAR-T细胞回输治疗验证了小鼠体内CRS现象的发生，为CAR-T细胞治疗相关CRS的发生机制及CRS预防策略提供了动物模型参考。

目的:制备含有L452R和T478K突变位点的新型冠状病毒受体结合域（RBD）-破伤风类毒素蛋白（TT），表达后蛋白免疫小鼠以了解突变体蛋白的免疫原性。方法:设计2对新型冠状病毒引物对RBD中的L452R和T478K进行突变，并将TT肽的核苷酸片段嵌入RBD中；利用大肠埃希菌表达系统表达蛋白，借助离子柱层析技术纯化出目的蛋白，复性获得空间构象后通过ELISA、高效液相和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）等进行检定；免疫小鼠后ELISPOT检测其细胞免疫水平；用竞争法ELISA和活病毒中和试验评估其中和抗体对新型冠状病毒流行突变株的抑制能力。结果:成功构建了新型冠状病毒RBD的L452R和T478K突变蛋白，蛋白相对分子质量为26 390。小鼠免疫后产生了特异性的细胞免疫，突变蛋白组刺激后产生的分泌IFN-γ的效应T细胞为（21.43±11.71）个斑点形成细胞/5×10 5个细胞,高于对照组（3.38±2.56）个斑点形成细胞/5×10 5个细胞，差异有统计学意义（ t= 4.17, P=0.003）；同时产生了针对新型冠状病毒德尔塔、奥密克戎（BA.1）流行株的高滴度中和抗体，中和滴度几何平均数分别为3 012.28和1 086.12。 结论:本研究所构建的L452R和T478K突变蛋白对流行的新型冠状病毒德尔塔、奥密克戎（BA.1）流行株有效，为开发重组广谱的新型冠状病毒疫苗提供依据。

目的:构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体特异性嵌合抗原受体(EGFR-CAR)和程序性死亡受体-配体1(PD-L1)抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:人PD-L1-Fc蛋白免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、亚克隆筛选高分泌PD-L1特异性抗体的稳定杂交瘤，酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot检测抗体特异性，流式细胞术(FACS)鉴定对PD-1配受体封阻性能，Fortebio测定抗体亲和力，抗体全长测序，经保留鼠源CRD1、CRD2和CRD3人源化改造后构建单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)；人EGFR单克隆抗体杂交瘤系，经5′RACE技术扩增其轻链和重链可变区(VL和VH)基因，构建scFv，克隆至真核载体pcDNA3.1表达鉴定。基因合成EGFR-CAR(引入CD137协同信号胞内功能域)与PD-L1-scFv借助2A序列连接，克隆入慢病毒pLVX-EF1a-IRES-ZsGreen1表达载体，使用Lenti-X Packaging Single Shots (VSV-G)共同转染293T细胞，获得包装病毒，感染293V细胞，FACS测定CAR膜表达，ELISA检测CAR感染293V细胞培养上清中PD-L1-scFv表达情况，转染激活人外周血T细胞，验证CAR膜表达。结果:获得PD-L1抗体11E3，具备高度配受体封阻性能，经人源化改造后，亲和力稳定(2.67×10 －10 mol/L)，EGFR-scFv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR(CTC0537-1)及膜表达型CAR(CTC0537-2)，其病毒感染293V细胞阳性率为10%。CTZ0431-1感染293V细胞后，细胞膜表面表达EGFR-scFv，检测培养上清存在PD-L1-ScFv；CTZ0431-2感染293V细胞后，细胞膜表面EGFR-scFv和PD-L1-scFv有效表达，双表达病毒感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。 结论:成功构建了EGFR-CAR和PD-L1-scFv双表达慢病毒载体，EGFR-CAR中度结合亲和力，此为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。

膜性肾病是一种具有不同病因的肾脏疾病病理组织学类型，典型特征为上皮下免疫复合物沉积引起的肾小球基底膜增厚，临床主要表现为肾病综合征或无症状蛋白尿。利妥昔单抗是一种特异性针对B细胞表面抗原CD20的人鼠嵌合型单克隆抗体。近年来，利妥昔单抗逐渐用于膜性肾病的治疗中，取得了良好的疗效。为规范国内利妥昔单抗治疗膜性肾病的临床应用，为临床医生提供实践指导，北京大学医学部肾脏病学系专家组通过检索Pubmed、中国知网数据库、万方数据库和维普数据库等中英文相关医学文献，并结合我国临床诊疗现状，形成本共识。

在 CRISPR/Cas9 系统介导的基因编辑中,借助于双链 DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用.为提高CRISPR/Cas9 系统介导 dsDNA 供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因 LacI 分别与脓链球菌(Streptococcus pyogenes)源的 SpCas9 和路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统(donor adapting system,DAS).首先在报告载体水平上对Cas9 核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复(homology-directed repair,HDR)效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用 CRISPR/SlugCas9-hLacI DAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达 30.5%,显著高于野生型.综上所述,本研究开发了新型的 CRISPR/Cas9-hLacI 供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9 基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具.

目的 对我站检验科发现的1例ABO血型正、反定型不一致的献血者标本,通过血型血清学实验方法和分子生物学实验方法确定其血型,并对其正反定血型不一致产生的原因进行讨论分析.方法 血型血清学实验方法;PCR-SSP法;PCR基因扩增测序法.结果 血型血清学结果为B亚型;PCR-SSP法结果为OB;PCR基因扩增ABO 6、7号外显子测序结果为ABO*O.01.01/O.01.01;单倍测序实验中采用B基因特异性引物扩增后观察到B基因特异性序列.结论 该献血者为B/O嵌合血型,存在少量B基因表达出了B抗原活性.

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是由外力引起的脑正常功能破坏和/或脑组织病理性损伤.由于发生功能神经元不可逆的丧失和神经组织损伤,中枢神经系统在创伤后很难修复和再生,造成TBI患者预后存在严重后遗症.由于缺乏概括人脑特征的TBI模型,虽然有大量成功的临床前研究用于TBI治疗,但少有转化应用.脑类器官作为一种自我组装的3D组织,具有来自干细胞和器官特异性细胞类型的集合,能够在一定程度上模拟天然脑器官的结构和功能,应用于TBI研究,能够有效地解决人中枢神经系统组织获取的局限性以及人和动物之间的生物学特征不匹配问题.因此,本文通过对脑类器官的产生、特性及其在TBI模型中的应用进行综述,重点讨论了基于人多能干细胞(hPSCs)的脑类器官模拟体外TBI模型和嵌合动物TBI模型研究进展,以期为脑类器官应用于TBI损伤的研究及治疗提供新思路.