报道广西来宾市1例片形吸虫病诊疗和流行病学调查过程,为片形吸虫病预防控制提供依据.患者因上腹部疼痛到医院就诊,根据患者主要症状、体征、临床表现,经腹部B超、CT检查及粪便水洗沉淀法镜检发现片形吸虫卵,提取虫卵DNA经ITS2基因扩增、测序和比对,与NCBI巨片形吸虫ITS2序列同源性为99.2％,确诊患者为巨片形吸虫病,经三氯苯达唑驱虫治疗后症状消失、粪便复查虫卵阴性.以水洗沉淀法检测患者周边33份人粪便样本和以压片镜检200份小土蜗螺及20份尖膀胱螺检测片形吸虫卵均为阴性;检测患者居住地附近10份水牛粪便,有8份(占80％)检测到片形吸虫卵,ITS2基因扩增、测序证实为巨片形吸虫;收集患者种植并腌制生吃芋檬10份,也未发现片形吸虫囊蚴粘附.结果表明,本次病例是1例偶然的片形吸虫感染病例,患者临床症状缺乏特异性,需结合大便虫卵检查和分子诊断进行确诊.

目的 了解内蒙古乌审旗地区牛、羊片形吸虫感染情况.方法 2022年8月至2023年3月在乌审旗嘎鲁图、苏力德苏木、乌兰陶勒盖、乌审召和图克镇采集牛、羊血样和粪样,间接ELISA检测血清抗肝片形吸虫抗体,随机抽取部分血清抗体检测样品对应的牛、羊粪样,采用虫卵沉淀法定性检查虫卵,对血清抗体检测和粪样虫卵检查结果进行一致性检验.2023年4月,在嘎鲁图、苏力德苏木和图克镇因感染片形吸虫死亡牛、羊尸首的肝脏和胆汁中采集片形吸虫成虫和虫卵,提取虫体和虫卵DNA,PCR扩增片形吸虫核糖体内转录间隔区2(ITS2)并测序,在NCBI数据库中进行BLAST比对分析,采用邻接法构建系统进化树.采用SPSS 25.0软件进行统计学分析,不同地区的阳性率的比较采用x2检验.结果 共采集825份牛、羊血样,其中295份血清肝片形吸虫抗体阳性,总阳性率为35.8％(295/825),羊、牛阳性率分别为34.7％(227/655)、40.0％(68/170).羊血清阳性率以苏力德苏木最高[81.8％(45/55)],乌审召镇最低[22.0％(27/123)],不同地区血清抗体阳性率差异有统计学意义(x2=73.93,P＜0.05).牛血清抗体阳性率以嘎鲁图镇最高[65.1％(28/43)],图克镇最低[19.2％(5/26)],不同地区血清抗体阳性率差异有统计学意义(x2=21.50,P＜0.05).共抽取88份牛、羊粪样(羊粪样59份,牛粪样29份)检查,其中1份羊粪样、5份牛粪样检出肝片形吸虫虫卵,4份牛粪样检出同盘吸虫虫卵.88份牛、羊血样、粪样样品中,血清肝片形吸虫抗体的阳性率为29.5％(26/88),粪样肝片形吸虫卵的阳性率为6.8％(6/88),kappa值为0.086,两种方法的一致性为微弱.从2头牛体内收集到成虫和虫卵,从2头羊体内收集到成虫.共取5条成虫和2份虫卵提取DNA,PCR扩增共获得7条约550 bp的条带.BLAST比对分析结果显示,4条序列与来自中国的巨片形吸虫ITS2(GenBank:HQ700438)的序列一致性分别96.62％、95.91％、95.74％和92.97％,鉴定为巨片形吸虫;3条序列与来自中国的肝片形吸虫ITS2(GenBank:JF496717)的序列一致性分别为95.69％、99.80％和99.23％,鉴定为肝片形吸虫.系统进化树分析结果显示,本研究鉴定的肝片形吸虫与来自中国(GenBank:JF496717)、肯尼亚(GenBank:MZ396926)、埃及(GenBank:MW620063)的肝片形吸虫聚在同一分支上;巨片形吸虫与来自中国(GenBank:HQ700438)和印度(GenBank:OL691113)的巨片形吸虫聚在同一分支上.结论 内蒙古乌审旗地区牛、羊均存在肝片形吸虫和巨片形吸虫感染,片形吸虫的感染率较高.

目的 通过线粒体nad1和细胞核ITS1序列,对从云南省玉溪地区一女性片形吸虫病患者体内取出的2条片形吸虫成虫进行虫种鉴定,获知寄生于人体的片形吸虫种类.方法 片形吸虫标本保存于75％乙醇溶液,提取全基因组DNA,PCR扩增线粒体基因NADH脱氢酶亚基1(nad1)和细胞核rDNA的第一内转录间隔区(ITS1)序列,正反引物双向测序.所测序列与GenBank中Fasciola属相关同源序列组成DNA数据集,进行ITS1单倍型分析和构建nad1的NJ系统发育树.结果测得片形吸虫标本的ITS1和nad1序列长度分别是422 bp和542bp.2条片形吸虫标本的nad1序列完全一致,属于F.gnigan tica(Fg型).但是ITS1单倍型不一致,标本YXGD01在该基因中属于F.gigantica (Fg型),标本YXGD02属于F.hepatica (Fh型).基于nad1DNA数据集构建的NJ系统发育树,明显分为F.gigantica和F.hepatica 2个类群.结论 基于线粒体nad1和细胞核ITS1序列,从云南省玉溪地区一片形吸虫病患者体内取出的2条片形吸虫属于不同类型,标本YXGD01鉴定为F.gigantica,标本YXGD02可能是F.gigantica与F.hepatica杂交生成的中间型个体,但需要更多的实验证据.

目的 应用SDS-PAGE对肝片形吸虫和巨片形吸虫成虫蛋白组分进行比较分析,并Western blot检测其特异性蛋白分子. 方法 分别收集肝片形吸虫和巨片形吸虫成虫,冰上研磨匀浆,提取上清蛋白,采用SDS-PAGE分析肝片形吸虫和巨片形吸虫差异蛋白组分;应用Western blot检测特异蛋白组分. 结果 虫体蛋白经SDS-PAGE后采用Gel Doc XR+凝胶成像系统对电泳图像进行高灵敏度分析,巨片形吸虫和肝片形吸虫成虫均有37条带,低灵敏分析显示肝片形吸虫成虫蛋白主要7条带,巨片形吸虫成虫蛋白主要有6条带,相对分子质量集中在10×103～70×103.Western blot检测巨片形吸虫有6条反应带,分别在150×103、100×103、75×103、50×103、34×103、23×103等位置;肝片形吸虫5条反应带,分别在55×103、37×103、34×103、23×103、15×103等位置.与血吸虫、囊虫、广州管圆线虫、旋毛虫的交叉反应蛋白为75×103、100×103、75×103组分(巨片形吸虫)和60.34×103组分(肝片形吸虫). 结论 肝片形吸虫成虫与巨片形吸虫成蛋白组成有差异不明显,抗原特异的蛋白在23×103、15×103等位置,且22×103～24×103组分占比较大(在在肝片形吸虫占48.4％,巨片形吸虫与77.3％).其特异的蛋白酶类有待经质谱分析后用于诊断抗原及疫苗研究,而15×103组分可能是肝片形吸虫特有的可区别于巨片形吸虫的蛋白.

片形吸虫是牛羊及其他哺乳动物胆管内常见寄生虫,主要有肝片形吸虫和巨片形吸虫,两者形态相似,对其鉴定一直是研究的热点之一.近年来现代生物学技术已广泛运用于寄生虫的分类学研究,本文拟阐述染色体分析、蛋白质多态性以及分子遗传学技术用于片形吸虫种类鉴定的研究进展,揭示片形吸虫的种内差异,种间差异和亲缘关系.

目的 基于核糖体第一内转录间隔区(ITS1)、线粒体细胞色素c氧化酶亚基(COX1)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1(NAD1)序列初步鉴定云南省大理州地区片形吸虫的种类. 方法 于大理州下关农贸市场采集4头感染片形吸虫牛的肝脏,分离片形吸虫成虫,并孵育以获得其虫卵.分别提取片形吸虫成虫及虫卵的基因组DNA,PCR扩增核糖体ITS1,线粒体COX1和NAD1序列并测序,所得序列经BLAST在线工具进行比对,鉴定虫种;采用BioEdit软件进行多序列比对,分析片形吸虫亲代及子一代的遗传变异情况. 结果 共获得64条片形吸虫成虫,核糖体DNA的ITS1序列扩增产物长422 bp,出现5个变异位点.64条片形吸虫成虫中有5条(7.81％)与GenBank中肝片形吸虫的ITS1序列(登录号:AM709612)相似度为100％,其余59条(92.19％)均同时携带肝片形吸虫和巨片形吸虫的序列特征,为Fg/Fh杂合型片形吸虫;测序图谱中5个变异位点均出现双峰,个体间双峰比值存在明显差异,从Fg∶Fh≥10∶1到Fg∶Fh≤1∶10不等.线粒体DNA的NAD1和COX1序列扩增产物长度分别为535 bp和438 bp,变异位点分别为47个和41个.其中1条成虫(1.56％)与GenBank中肝片形吸虫的NAD1序列(登录号:GQ175363)、COX1序列(登录号:GQ398051)相似度为100％,另63条(98.44％)与巨片形吸虫的NAD1序列(登录号:AB207168)、COX1序列(登录号:AB207177)相似度为99.81～100％.虫卵线粒体COX1、NAD1序列与母本完全一致;ITS1序列分型与母体完全一致,但其杂合程度存在分化现象. 结论 云南省大理地区片形吸虫种群以“杂合型”片形吸虫为主,同时存在极少量纯种肝片形吸虫.

目的 了解广西片形吸虫中间宿主小土蜗和终宿主水牛的感染情况. 方法 2018年4-10月,于广西横县、宾阳、隆安、都安、大化和来宾等6个县(市)收集小土蜗和水牛粪便,小土蜗通过压片镜检查找幼虫,水牛粪样采用水洗沉淀法查找虫卵,对发现的片形吸虫幼虫和虫卵提取DNA,进行内转录间隔区2(ITS2)序列PCR扩增和鉴定. 结果 共采集1 523只小土蜗,片形吸虫平均感染率为0.3％ (5/1 523),除大化县和都安县采集的小土蜗未发现片形吸虫感染外,横县、宾阳、隆安、来宾等4个县(市)采集的小土蜗均存在片形吸虫感染.共采集128份水牛粪样,平均感染率为79.7％ (102/128).6个县(市)水牛均存在片形吸虫感染,其中来宾市水牛感染率最高,为88.2％ (15/17);都安县水牛感染率最低,为64.0％ (16/25).片形吸虫ITS2序列PCR扩增长度约为500 bp.小土蜗中片形吸虫幼虫ITS2序列与巨片形吸虫的ITS2序列(GenBank登录号为KF667375.1)的相似性为98.8％ ～99.0％,水牛粪样中片形吸虫虫卵ITS2序列与巨片形吸虫的ITS2序列(GenBank登录号为KF667375.1)的相似性为98.4％ ～99.4％. 结论 广西相关调查点的小土蜗和水牛均存在巨片形吸虫感染,人群存在感染风险,应加强防控.

目的 基于核糖体内转录间隔区(ITS+,包括ITS1、5.8S和ITS2及其侧翼序列)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基Ⅰ (NAD Ⅰ)、线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(COX Ⅰ)序列和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因(pepck多重PCR初步鉴定广西南宁地区采集的片形吸虫的种类.方法 于南宁市某屠宰场采集11头感染片形吸虫的牛肝脏,分离片形吸虫成虫,并孵育获得虫卵.提取片形吸虫成虫的基因组DNA,PCR扩增ITS+、NAD Ⅰ和COX Ⅰ序列并测序,所得序列经BLAST在线工具进行比对,并结合pepck基因多重PCR鉴定虫种;提取部分片形吸虫的虫卵基因组DNA,PCR扩增ITS+序列并测序;采用BioEdit软件进行多序列比对,分析片形吸虫亲代及子一代的遗传变异情况.结果 共获得151条片形吸虫成虫,ITS+序列扩增产物长964 bp,仅NN20-2为Fh型,与GenBank中瑞士肝片形吸虫(登录号:MK321602)的同源性为100％;NN17-11、NN20-9和NN20-14携带巨片形吸虫和肝片形吸虫的双重序列特征,属于Fg/Fh杂合型,序列图谱上特定变异位点出现双峰,个体间双峰比值存在明显差异,NN17-11为Fg∶Fh=1∶1,NN20-9和NN20-14为Fg∶Fh=1∶5;其余147个样本是Fg型,可细分为19个亚型,其中NN4-1等100个虫体与GenBank中越南巨片形吸虫(登录号:MN970009)的同源性为100％,其余虫体中共出现14个变异位点,多为双峰.线粒体基因NAD Ⅰ和COX Ⅰ序列扩增产物长度分别为535 bp和438 bp,分别有34、22个变异位点,细分为28、21种单倍型,所有虫体的NAD Ⅰ和COX Ⅰ均属于巨片形吸虫类群.pepck PCR产物电泳显示NN17-11、NN20-2、NN20-9和NN20-14等4个虫体出现巨片形吸虫和肝片形吸虫的双重条带,其它样本只有巨片形吸虫的单条带.虫卵的ITS+序列结果显示,ITS-Fh型片形吸虫NN20-2成虫有1个虫卵(1/30)转变为Fg/Fh型;巨片形吸虫NN20-3成虫有5个虫卵(5/30)呈现Fg/Fh型,其余虫卵与母体基本一致.结论 广西南宁地区片形吸虫种群以纯种巨片形吸虫为主,同时存在少量杂合型片形吸虫.