目的:探讨Smad4作为微小RNA(miRNA，miR)-301a调控的靶基因的证据，以及介导高糖促进前列腺癌细胞增殖的作用。方法:采用TargetScan和PicTar数据库寻找miR-301a的分子靶点。采用转染miR-301a模拟物、实时定量聚合酶链反应及蛋白质印迹法(Western blot)法[25 μg，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)]检测miR-301a和Smad4的表达，双荧光素酶报道基因实验检测miR-301a对Smad4的调控，细胞计数试剂盒(CCK-8)法(10 μl/孔CCK-8溶液，2 h)测定细胞增殖，以流式细胞术进行细胞周期分析。两组数据的均数检验采用 t检验。 结果:生物信息学分析及荧光素酶报道实验均表明Smad4是miR-301a的靶点，上调miR-301a后，Smad4 mRNA及蛋白表达均明显降低。同时上调miR-301a及Smad4表达96 h后，前列腺癌细胞增殖能力升高160%( P<0.05)，差异有统计学意义。miR-301a可抑制Smad4的表达，从而促进细胞从G 1期向S期过渡。在PC-3细胞，转染miR-301a前的细胞周期比例为G 0/G 1 62.60%，S28.00%，G 2/M 9.40%；转染后为G 0/G 1 49.97%，S 41.04%，G 2/M 8.99%(转染前后G 0和S期的比例差异有统计学意义， P<0.05)；在DU-145细胞，转染miR-301a前G 0/G 1 65.16%，S 24.54%，G 2/M 10.30%；转染后G 0/G 1 53.34%，S 36.67%，G 2/M1 0.00%(转染前后G 0和S期比例差异有统计学意义， P<0.05)。沉默Smad4的表达导致，细胞周期的G 1期缩短，S期延长，与过表达miR-301a的结果相似；过表达Smad4可阻断miR-301a诱导的G 1/S期转化。 结论:miR-301通过下调靶蛋白Smad4的表达来调控前列腺癌细胞增殖。Smad4在高糖相关的前列腺癌生长中发挥重要作用。

目的 探讨抑制miR-301a对胶质瘤U87细胞增殖、凋亡和侵袭的影响.方法 体外培养人脑胶质瘤U87细胞,将细胞分为空白对照组、阴性转染组(阴性序列转染U87细胞)、miR-301a抑制剂转染组(miR-301a抑制剂转染U87细胞).采用MTT法检测各组细胞的增殖;平板细胞克隆形成实验检测菌落形成;划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell法检测细胞迁移、侵袭能力;流式细胞仪检测细胞的凋亡率;RTPCR法检测细胞中miR-301a、PTEN mRNA表达;Western blot检测细胞PTEN、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、Caspase-9蛋白表达.结果 与空白对照组、阴性转染组比较,miR-301a抑制剂转染组转染后不同时间点的细胞抑制率均升高,呈时间依赖性(均P＜0.05).miR-301a抑制剂转染组的菌落数量明显降低,迁移距离短,细胞迁移、侵袭数量明显降低,细胞凋亡率升高(均P ＜0.05);miR-301amRNA表达水平降低,PTEN mRNA表达水平升高;PTEN、Bax、Caspase-3、Caspase-9蛋白表达水平明显升高,Bcl-2蛋白表达水平降低(均P＜0.05).结论 抑制miR-301a的表达,可抑制胶质瘤U87细胞的增殖、迁移、侵袭能力,促进胶质瘤U87细胞凋亡.

目的:检测白塞氏病(BD)患者和正常人群血浆中微小核糖核酸(microRNA,miRNA)的差异表达谱,探讨miRNA在BD发病中的作用,寻找与BD相关的血浆生物标记物.方法:收集15例活动期BD患者和15例正常人的抗凝静脉血,离心获得血浆,提取总RNA,经miRNA标记、miRNA阵列杂交、miRNA阵列扫描和分析获得BD患者异常表达的miRNA谱.通过miRTarBase(靶基因数据库)检索差异性表达的miRNA已经过验证的靶基因,并选取与免疫学相关的差异性表达的miRNA进行Real time-PCR验证.结果:活动期BD患者血浆中hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-144-3p、hsa-miR-483-3p较正常人表达上调,hsa-miR-301a-3p、hsa-miR-224-5p、hsa-miR-454-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-199a-5p较正常人表达下调.结论:miRNA的差异性在BD的发生发展过程发挥重要作用,异常表达的miRNA可能通过Notch1和SMAD4信号通路促进BD发病.

目的 探讨miRNA-301a-3p对结直肠癌细胞HCT-8化疗敏感性的影响及可能的作用机制.方法 采用CCK-8法检测结直肠癌亲本细胞株HCT-8和对5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药细胞株HCT-8/FU化疗敏感性,RT-PCR法检测miRNA-301a-3p和PTEN基因在HCT-8和HCT-8/FU细胞中的表达.在HCT-8/FU细胞中转染miRNA-301a-3pinhibitor,CCK-8检测化疗敏感性.通过生物信息学软件分析miRNA-301a-3p的下游靶基因,双莹光素酶报告基因法进行验证.观察抑制PTEN的表达对化疗敏感性的影响,并检测抑制miRNA-301a-3p表达后对PTEN、AKT及pAKT蛋白表达的影响.结果 HCT-8/FU细胞株的化疗敏感性明显低于HCT-8细胞株.miRNA-301a-3p在HCT-8/FU细胞中的表达明显高于HCT-8细胞,但PTEN在HCT-8/FU细胞中的表达则明显低于HCT-8细胞.miRNA-301a-3pinhibitor抑制HCT-8/FU细胞中miRNA-301a-3p的表达后,HCT-8/FU细胞化疗敏感性明显增高.PTEN是miRNA-301a-3p的靶基因.抑制PTEN表达可降低HCT-8/FU细胞化疗敏感性,抑制miRNA-301a-3p表达可提高PTEN蛋白表达,并下调pAKT蛋白表达.结论 下调HCT-8/FU细胞株中miRNA-301a-3p的表达可提高细胞的化疗敏感性,其机制可能与miRNA-301a-3p/PTEN/AKT信号通路有关.

目的:研究大鼠星形胶质细胞中微小RNA-301a-3p(miR-301a-3p)对缝隙连接蛋白43(Cx43)表达的靶向调控作用及其作用位点.方法:合成miR-301a-3p agomir和miR-301a-3p antagomir,转染至星形胶质细胞,Western blot检测各组细胞中Cx43蛋白的表达情况;构建重组载体wt-pEZX-MT05-Cx43和mut-pEZX-MT05-Cx43,采用双萤光素酶报告基因实验验证miR-301a-3p的靶基因;构建表达载体pcDNA3.1-Cx43,通过回复实验分析miR-301a-3p对细胞凋亡的影响.结果:将miR-301a-3p agomir转染到星形胶质细胞后,Western blot检测显示,与对照组相比,Cx43蛋白表达显著降低(P<0.05).双萤光素酶报告基因实验结果表明,miR-301a-3p能够与Cx43的3'-UTR结合,对其表达产生负调控;将不含Cx433'-UTR的重组载体pcDNA3.1-Cx43转染星形胶质细胞后,能够回复miR-301a-3p对Cx43蛋白表达的负调控作用,引起细胞凋亡.结论:Cx43是miR-301a-3p的一个靶基因,miR-301a-3p通过作用于Cx43 mRNA的3'-UTR而抑制其在大鼠星形胶质细胞中的表达.

目的 对影响乳腺癌(BRCA)预后的微小RNA(miRNA)进行探索挖掘,并探讨hsa-mir-301b作用机制.方法 使用miRNA抑制剂干扰BRCA细胞中hsa-mir-301b的表达,qRT-PCR检测hsa-mir-301b的表达水平;CCK-8实验检测细胞增殖能力;miRDB数据库预测hsa-mir-301b靶基因,同时通过GEPIA网站进一步筛选出BRCA中低表达,提示预后不良的候选靶基因2个,应用ENCORI及RNAhybrid在线预测靶基因NR3C2与hsa-mir-301 b的靶向关系;Western blot检测NR3C2蛋白表达水平.结果 与癌旁组织相比,hsa-mir-301b在BRCA组织中显著高表达,且高表达患者预后不良;hsa-mir-301b在乳腺癌细胞系MCF-7细胞系中表达量低于正常乳腺上皮细胞MCF-10A的表达(P＜0.0001),抑制hsa-mir-301b表达后,细胞活力下降.NR3C2为hsa-mir-301b的靶基因.NR3C2在BRCA患者组织中低表达,且低表达提示预后不良,并与hsa-mir-301b存在负相关关系;其3'非编码区域与hsa-mir-301b存在结合位点;Western blot实验证明hsa-mir-301b抑制剂能够促进NR3C2蛋白水平表达.结论 hsa-mir-301b在BRCA患者组织中及MCF-7细胞中高表达,发挥癌基因作用,其抑制剂能够减弱BRCA细胞MCF-7的活力,干扰NR3C2的表达.

目的 通过数据挖掘分析长链非编码RNA(lncRNA)、微小RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA)在喉鳞状细胞癌中的相互作用机制.方法 从肿瘤基因图谱(TCGA)中获取喉鳞状细胞癌的lncRNA、miRNA、mRNA表达谱数据及相关临床数据,从TCGA和GEO数据库中获取喉鳞状细胞癌的DNA甲基化数据.进行蛋白相互作用(PPI)、基因文本(GO)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)信号通路分析和Kaplan-Meier生存分析,构建竞争性内源RNA(ceRNA)网络和转录因子调控网络.结果 LINC00278、LINC00689、MYHAS、miRNA-99a和miRNA-301a属于低风险基因(HR<1);MNX1-AS1、LINC02575、HOXB-AS4、LSAMP-AS1、LINC02086、IG-FL2-AS1、LINC02253、CASC20、miRNA-383、miRNA-196a-2、miRNA-196a-1、miRNA-100和miRNA-4652属于高风险基因(HR>1).ceRNA网络中有11个lncRNA(LINC02576、LINC02086、AC020659.1、LINC00528、LINC00689、HOXB-AS4、MNX1-AS1、LINC00278、AC010624.1、AC016773.1、MYHAS)、5个miRNA(has-miRNA-206、has-miR-NA-573、has-miRNA-3662、has-miRNA-133b、has-miRNA-449a)和12个mRNA(STC2、PAX3、NETO2、EIF5A2、AD-PRHL1、SYNM、ACTA1、GPR156、CLIC5、BMP3、HNF4A、FOXL2).MYHAS的共表达mRNA(cor-mRNA)主要富集在钙信号通路、环磷酸鸟苷(cGMP)-cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)信号通路和催产素信号通路等.转录因子网络中有9个转录因子(MYOD、RSRFC4、TAL1BETAITF2、YY1、P300、PAX3、PAX5、ZID和OLF1).喉鳞状细胞癌DNA甲基化分析得到75个甲基化位点,对应高甲基化基因56个,低甲基化基因15个.结论 ceRNA网络并不能完全阐释lncRNA、miRNA和mRNA在喉鳞状细胞癌发生中的作用机制,lncRNA、miRNA和mRNA在喉鳞状细胞癌发生过程中既相互联系又相互独立.筛选出的lncRNA、miRNA和mRNA为试验验证缩小了范围并提供了理论基础.MYHAS在喉鳞状细胞癌中发挥重要作用,是一个潜在的生物学靶点.

目的 探讨靶向维生素D受体(VDR)基因的miRNA及其对继发性甲状旁腺功能亢进甲状旁腺激素(PTH)分泌的影响.方法 用胶原酶消化法提取、分离和培养出继发性甲状旁腺功能亢进的甲状旁腺组织的原代细胞;运用生物信息学方法及全转录组测序的方法筛选得到靶向VDR的miRNA,双荧光素酶报告基因实验验证筛选出的miRNA与VDR的靶向关系;qRT-PCR及Western blotting检测过表达或抑制miRNA后的对VDR mRNA水平及蛋白水平和对PTH分泌的影响;qRT-PCR和免疫组织化学分别验证部分miRNA、VDR mRNA和蛋白水平的表达差异.结果 成功培养得到甲状旁腺原代细胞;筛选并验证了hsa-miR-149-5p、hsa-miR-221-5p、hsa-miR-222-3p、hsa-miR-29a-5p、hsa-miR-301a-5p、hsa-miR-873-5p、hsa-miR-93-3p均与VDR存在靶向关系;筛选并验证的7个miR中,过表达hsa-miR-149-5p、hsa-miR-301a-5p PTH分泌增加.hsa-miR-149-5p在继发性甲状旁腺功能亢进中高表达(P=0.046),VDR mRNA(P=0.0267)和蛋白水平表达均下降.结论 hsa-miR-149-5p、hsa-miR-301a-5p可能通过下调VDR基因的表达促进继发性甲状旁腺功能亢进患者PTH的分泌.

[目的]探讨miR-301影响冠心病大鼠心肌细胞凋亡的机制.[方法]SD大鼠随机分为对照组、模型组、miR-301激动剂组(agomir miR-301组)、miR-301激动剂对照组(agomir NC组)、Wnt/β-catenin通路抑制剂组(Dkk1组)及agomir miR-301+Dkk1组,每组10只.除对照组外,其余各组均高脂喂养建立大鼠冠心病模型,连续给药1周后,超声检测大鼠左心室射血分数(LVEF)、左心室短轴缩短率(FS)、左心室舒张期末内径(LVEDD)和左心室收缩期末内径(LVESD)等心功能指标.HE染色观察大鼠心肌组织形态,TUNEL检测心肌细胞凋亡,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测心肌组织miR-301表达,Western blot检测大鼠心肌组织Caspase-3、Bax、Wnt3a及β-catenin蛋白表达.[结果]与对照组相比,模型组大鼠LVEF、FS降低49.2％、49.1％,心肌组织miR-301表达水平降低 69.0％,Wnt3a、β-catenin 蛋白表达水平降低 60.7％、39.7％(P＜0.05),LVEDD、LVESD 升高 32.2％、99.6％,心肌细胞凋亡率升高1362.6％,心肌组织Caspase-3、Bax蛋白表达水平升高100.0％、114.6％(P＜0.05);与模型组相比,agomir miR-301组大鼠LVEF、FS升高71.4％、71.8％,心肌组织miR-301表达水平升高1935.5％,Wnt3a、β-catenin 蛋白表达水平升高 102.4％、45.1％(P＜0.05),LVEDD、LVESD 降低 15.6％、39.2％,心肌细胞凋亡率降低65.0％,心肌组织Caspase-3、Bax蛋白表达水平降低70.2％、78.4％(P＜0.05),而Dkk1可逆转这种现象.[结论]miR-301通过激活Wnt/β-catenin信号通路改善冠心病大鼠心肌细胞凋亡.

目的 探索脾虚状态下外泌体促肝癌转移的机制.方法 使用随机数字表法将C57BL/6小鼠随机分为4组:正常对照组、脾虚组、肝癌组、脾虚肝癌组,每组10只,正常对照组腹腔注射生理盐水,脾虚组腹腔注射利血平,肝癌组采用肝癌原位移植术,脾虚肝癌组采用腹腔注射利血平加肝癌原位移植术.利血平腹腔注射共持续21天,确定脾虚模型建立后再行肝癌原位移植术,术后14天取材.基于模型血浆提取小鼠外泌体并使用电镜、颗粒分析及纳米流式鉴定.以外泌体为变量使用划痕实验、Transwell迁移与侵袭实验、尾静脉肺转移裸鼠模型验证脾虚状态下外泌体促肝癌转移的表型.随后对肝癌组和脾虚肝癌组外泌体进行miRNA测序鉴定差异miRNAs,并分析miRNAs靶向的mRNAs的通路富集结果.结果与肝癌组比较,脾虚肝癌组小鼠的脾虚积分更高(p＜0.0001)及肿瘤体积更大.电镜、颗粒分析及纳米流式结果成功鉴定外泌体.划痕实验、Transwell迁移及侵袭实验结果表明脾虚肝癌组外泌体在体外促进了肝癌细胞的转移能力(P＜0.0001).尾静脉肺转移裸鼠模型的活体成像结果表明脾虚肝癌组外泌体在体内促进了肝癌细胞的转移能力.外泌体miRNA测序结果表明15个miRNAs在脾虚肝癌组差异表达,其中 9 个上调(miR-183-3p,miR-1247-5p,miR-543-3p,miR-495-3p,miR-466i-5p,miR-540-5p,miR-125b-5p,miR-214-3p,miR-499-5p),6 个 下 调(miR-6516-5p,miR-450a-3p,let-7g-3p,miR-103-5p,miR-5129-3p,miR-301b-3p).差异表达miRNAs靶向的mRNAs富集的通路与转移相关(Wnt signaling pathway).结论 脾虚内环境来源的状态下外泌体通过miRNA-mRNA轴促进肝癌转移.